陳琳琳, 鄭秋月, 仲啟帆, 陳秋穎,劉筱潔, 于海龍, 陳應(yīng)柱

(1. 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 神經(jīng)內(nèi)科, 江蘇省蘇北人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 江蘇 揚(yáng)州, 225001; 2. 南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 江蘇 儀征, 215004)

研究[1-4]發(fā)現(xiàn)編碼前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)的基因突變可引起遺傳性家族性高膽固醇血癥(ADH)的發(fā)生，影響缺血性卒中發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)以及氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的生物學(xué)特性，從而直接促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。PCSK9 E670G(rs505151)突變是較為常見的突變類型，許多研究發(fā)現(xiàn)PCSK9 E670G多態(tài)性與缺血性卒中具有相關(guān)性，但是來自不同人群及年齡的研究結(jié)果卻存在差異性。本研究檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化型缺血性卒中患者的PCSK9 E670G基因型以及血液中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的水平，探討E670G多態(tài)性在動(dòng)脈粥樣硬化型缺血性卒中及其亞型中的發(fā)生頻率，以及與動(dòng)脈粥樣硬化型缺血性卒中及其亞型的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年9月—2017年4月蘇北人民醫(yī)院東院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的動(dòng)脈粥樣硬化型缺血性腦卒中患者216例為病例組，年齡27～94歲，均為漢族，彼此無親緣關(guān)系。參照疾病國際分類標(biāo)準(zhǔn)第9版(ICD-9)及中國1995年腦血管疾病分類與性卒中。動(dòng)脈粥樣硬化型腦卒中各亞型診斷依據(jù)嚴(yán)格的神經(jīng)學(xué)檢查、CT及MRI等影像學(xué)檢查。排除標(biāo)準(zhǔn): 無癥狀性腦卒中患者; 其他類型的缺血性腦卒中患者，包括心源性栓塞型、小動(dòng)脈閉塞型、其他原因型或不明原因型、短暫性腦缺血發(fā)作及出血性腦卒中者; 有心臟病史(風(fēng)濕性心臟病、心肌病等)和房顫的患者; 創(chuàng)傷或血管夾層引起的血管內(nèi)皮損傷、嚴(yán)重感染、結(jié)締組織病、自身免疫病、代謝病(糖尿病除外)和其他嚴(yán)重的慢性疾患者(如晚期肝硬化、未經(jīng)治療的甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)或減退等)。選取同期蘇北人民醫(yī)院東院神經(jīng)內(nèi)科的非腦卒中患者192例為對(duì)照組，均為無腦卒中癥狀的健康體檢者，按性別、居住地區(qū)、年齡與相應(yīng)病例匹配，均為漢族，彼此無親緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)同病例組。

1.2 研究方法

收集病例組與對(duì)照組的一般信息，如姓名、年齡、性別、高血壓史、糖尿病史、血脂等息。詢問病例組與對(duì)照組患者的飲食、吸煙、飲酒等生活習(xí)慣及既往病史和家族史。抽取病例組和對(duì)照組患者空腹12 h的外周靜脈血5 mL, 儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱。血生化指標(biāo)檢測(cè)由醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心完成，包括總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇。

1.3 DNA的提取

以人基因組DNA 樣品為模板，按已優(yōu)化好的條件進(jìn)行10 μL體系的PCR反應(yīng)，其中引物序列為PCSK9 E670G(上游引物): 5′-CACGGTTGTGTCCCAAATGG-3; PCSK9 E670G(下游引物): 3′-GAGAGGGACAAGTCGGAACC-5′。PCR反應(yīng)體系: 總反應(yīng)體系為10 μL, 包括基因組DNA模板5 μL, PCSK9 E670G F(20 μmol/L) 1 μL, PCSK9 E670G R(20 μmol/L) 1 μL, dNTP混合液(2.5 mmol/L) 4 μL, Taq聚合酶0.5 μL, 10X PCR Buffer 5 μL, PCR級(jí)超純水33.5 μL。反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性5 min, 隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s, 60 ℃退火30 s, 72℃延伸45 s), 72 ℃再延伸7 min, 4 ℃保存。采用限制性內(nèi)切酶Ear I進(jìn)行酶切, 37 ℃溫浴過夜，加酶切產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，紫外燈下觀測(cè)電泳結(jié)果并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包，觀察病例組與對(duì)照組的臨床特征，年齡、性別、吸煙、高血壓史和糖尿病史等為計(jì)數(shù)資料,Pearson卡方(χ2)檢驗(yàn)比較組間的差異。年齡、甘油三酯、HDL-C、血漿總膽固醇等指標(biāo)為計(jì)量資料，呈正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本Students′t檢驗(yàn)比較各組間均數(shù)。計(jì)算PCSK9基因E670G位點(diǎn)的等位基因頻率與基因型頻率在病例組和對(duì)照組的分布，采用卡方檢驗(yàn)判斷每個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的分布有無地區(qū)、性別差異。采用R×C表的Pearson卡方(χ2)檢驗(yàn)進(jìn)行E670G的位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析。不同基因型間LDL-C水平使用單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1 病例組與對(duì)照組臨床特征比較

病例組與對(duì)照組年齡、性別、總膽固醇(TC)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 2組在高血壓病史、糖尿病史、既往腦卒中史、吸煙史、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)方面有顯著差異(P<0.05), 見表1。

表1 病例組與對(duì)照組一般資料的比較

與對(duì)照組比較, *P<0.05

2.2 PCSK9基因E670G PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

PCSK9基因E670G PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果見圖1。

M: DNA 2000 marker; 1～7: samples(1為AA基因型, 2為GG基因型, 3～7為AG基因型)圖1 PCSK9基因E670G PCR產(chǎn)物酶切圖

2.3 PCSK9基因E670G位點(diǎn)多態(tài)性基因型和基因位點(diǎn)的分布

病例組基因型AA、AG、GG的例數(shù)依次為40例(18.5%)、124例(57.4%)、52例(24.1%)。對(duì)照組基因型AA、AG、GG的例數(shù)依次為70例(36.5%)、86例(44.8%)、36例(18.8%)。2組基因型頻率分布有顯著差異(P<0.05)。病例組等位基因A、G的例數(shù)依次為204例(47.2%)、228例(52.8%), 對(duì)照組依次為226例(58.9%)、158例(41.1%), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 PCSK9基因E670G位點(diǎn)與動(dòng)脈粥樣硬化型腦卒中及其亞型關(guān)聯(lián)性分析

缺血性腦卒中病例組各亞組(動(dòng)脈-動(dòng)脈栓塞亞型、穿支動(dòng)脈口閉塞亞型、低灌注栓子清除功能下降亞型、混合型亞型)的基因型分布無顯著差異(P>0.05)。將4個(gè)亞組與對(duì)照組比較, a組、b組的等位基因G的基因型頻率顯著增高(P<0.05), GG基因型的頻率也顯著增高(P<0.05); c組、d組的等位基因G、GG基因型頻率與對(duì)照組比較無顯著差異(P>0.05), 見表2。

2.5 PCSK9基因E670G多態(tài)性與LDL-C的相關(guān)性

GG基因型(n=52)的患者LDL-C水平為(3.10±0.66) mmol/L, 高于AG基因型(n=124)的(2.70±0.96) mmol/L與AA基因型(n=40)的(2.66±0.50) mmol/L, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 而AG基因型與AA基因型的LDL-C水平比較無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

研究[6]發(fā)現(xiàn)，血清中較高水平的LDL-C與動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈性心臟病(CAD)以及缺血性卒中風(fēng)險(xiǎn)升高相關(guān)。在基因因素導(dǎo)致的疾病中，抗利尿激素(ADH)與血液中異常升高的LDL-C濃度以及早期出現(xiàn)的CAD、缺血性卒中相關(guān)。編碼PCSK9蛋白的基因是與ADH相關(guān)的基因，研究[7]發(fā)現(xiàn)PCSK9蛋白是肝細(xì)胞表面上低密度脂蛋白受體(LDLR)活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，并且是治療高膽固醇血癥的作用靶點(diǎn)。研究[8-11]表明PCSK9的單核苷酸多態(tài)性(SNP)可以顯著影響血液中LDL-C的水平，并發(fā)現(xiàn)PCSK9 SNP中E670G(rs505151)基因的多態(tài)性與頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度、CAD以及缺血性卒中的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)E670G等位基因在大動(dòng)脈粥樣硬化(LAA)型缺血性卒中患者中的發(fā)生頻率明顯高于非卒中患者，在LAA型缺血性卒中各亞型分析中, E670G等位基因在動(dòng)脈-動(dòng)脈的栓塞亞型、

表2 PCSK9基因E670G等位基因與基因型頻率分布[n(%)]

a組: 動(dòng)脈-動(dòng)脈栓塞亞型; b組: 穿支動(dòng)脈口閉塞亞型; c組: 低灌注栓子清除功能下降亞型; d組: 混合型亞型。

與對(duì)照組比較, *P<0.05。

穿支動(dòng)脈口閉塞亞型的卒中患者中的發(fā)生頻率與非缺血性卒中患者有顯著差異。提示PCSK9 E670G等位基因是LAA型缺血性卒中的易感性基因, PCSK9 E670G等位基因可以增加LAA型缺血性卒中的風(fēng)險(xiǎn)，且主要發(fā)生在動(dòng)脈-動(dòng)脈栓塞、穿支動(dòng)脈口閉塞亞型中。Abboud等[12]研究發(fā)現(xiàn), E670G等位基因與LVA型卒中風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，而與SVO型卒中無相關(guān)性。Au等[13]在1項(xiàng)Meta分析中也曾報(bào)道, OLR1基因中的rs11053646與PCSK9 E670G(rs505151)的多態(tài)性與缺血性卒中易感性風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。Han等[14]研究揭示了PCSK9 rs505151的基因多態(tài)性與缺血性卒中風(fēng)險(xiǎn)并無明顯相關(guān)性，這可能與選取的缺血性卒中患者類型有關(guān)，以上研究均未對(duì)缺血性卒中進(jìn)行TOAST分型，而研究結(jié)果也只是在LAA型卒中患者中得到了rs505151基因多態(tài)性與卒中風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，在其他類型的卒中患者中并未得到一致的結(jié)果。人群種族來源以及地理環(huán)境的差異也可能導(dǎo)致結(jié)果的不一致性。

本研究還發(fā)現(xiàn)，血液中具有較高LDL-C水平的E670G等位基因攜帶者，其發(fā)生LAA型缺血性卒中的風(fēng)險(xiǎn)更高。推測(cè)LAA型卒中患者血液中LDL-C水平的升高，可能與LDL-C可以被氧化修飾成ox-LDL, 而ox-LDL能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞活化以及功能異常、巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的遷移[15-16], 導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、壞死以及凋亡的發(fā)生[17], 從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切有關(guān)[18-19]。炎癥反應(yīng)可進(jìn)一步促進(jìn)平滑肌細(xì)胞分泌PCSK9，而PCSK9不僅在泡沫細(xì)胞形成以及動(dòng)脈粥樣斑塊進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用[20], 其還能促使低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)活化，從而促進(jìn)平滑肌細(xì)胞對(duì)ox-LDL攝取，引起炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[21]。此外, PCSK9 E670G等位基因突變可使PCSK9與肝細(xì)胞表面的LDLR親和力增加，促進(jìn)LDLR降解，導(dǎo)致血液中LDL-C升高，也可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，間接升高LAA型卒中的風(fēng)險(xiǎn)。另外, PCSK9和ox-LDL可通過其他的機(jī)制相互作用，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，可能與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展有關(guān)。

總之，本研究結(jié)果表明, PCSK9具有直接以及間接促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的作用。PCSK9 E670G等位基因可能是動(dòng)脈粥樣硬化型缺血性卒中的新的危險(xiǎn)因素，主要在TOAST分型動(dòng)脈-動(dòng)脈栓塞、穿支動(dòng)脈口閉塞亞型中比較明顯，為動(dòng)脈粥樣硬化型缺血性卒中的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了新的方向。