樂曉卉， 孫忠芹， 陳洪魁， 楊留才，王 瑾， 仲 衛(wèi)， 史衛(wèi)紅， 劉 爽

(1.鹽城工學(xué)院 體育學(xué)院，江蘇 鹽城 224000；2.鹽城體育運(yùn)動學(xué)校 訓(xùn)練系，江蘇 鹽城 224000；3.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院 體育部等，江蘇 鹽城 224005；4.黑龍江佳木斯大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154000)

遺傳因素在運(yùn)動員選才中的應(yīng)用已受廣泛重視，目前主要集中在血管緊張素原基因、腺苷-磷酸脫氨酶1、低氧誘導(dǎo)因子1α、α輔肌動蛋白3等基因，而腎上腺素受體基因(adrenergic receptor,AR)的相關(guān)研究僅局限在β2和β3，但其主要分別存在于呼吸系統(tǒng)和脂肪組織中，而β1腎上腺素受體基因(β adrenergic receptor,β1AR)主要分布在心肌細(xì)胞中[1-4]，其通過改變Gs蛋白與β1AR結(jié)合部位產(chǎn)生功能效應(yīng)[5]，按照對有氧運(yùn)動能力起主要作用的骨骼肌來說，心肌供血比呼吸和脂肪作用更大，而檢索PUB-Med和CNKI，未見相關(guān)報道。

因此，本研究采用鹽城市的運(yùn)動員和體育專業(yè)的學(xué)生作為樣本，比較有氧運(yùn)動能力與血漿兒茶酚胺濃度的相關(guān)性，探討β1AR 49、389位蛋白質(zhì)的密碼子SNPS及其與有氧運(yùn)動能力的關(guān)聯(lián)性，為運(yùn)動員的基因選才研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選擇鹽城運(yùn)動學(xué)校、鹽城師范學(xué)院體育專業(yè)學(xué)生為實(shí)驗(yàn)組，對照組為同時期同地區(qū)的非體育專業(yè)未經(jīng)任何專業(yè)訓(xùn)練的健康學(xué)生，均為漢族，并征得本人或家長同意，所有受試者簽署知情同意書，兩組試驗(yàn)過程中均無脫落(脫落者刪除)，其基線資料分析如表1所示，其年齡、性別、身高和BMI差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具可比性。

表1 二組基線資料比較表

注：▲與實(shí)驗(yàn)組男相比◆與實(shí)驗(yàn)組女相比

1.2 儀器和試劑

微量高速離心機(jī)(北京鼎昊源MicroSmart)，生物安全柜(青島海爾HR40-II A2)，漩渦混合器(江蘇海門其林貝爾XW-80A)，掌上型迷你離心機(jī)(海門其林貝爾LX-400)，全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(ChampGelTM5000),全自動酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD)；無核酸酶水、Goldstar Best MasterMix、無水乙醇、血液基因組柱式小提試劑盒和蛋白酶K(均為北京康為世紀(jì))，人兒茶酚胺酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢新啟迪生物科技有限公司)，瓊脂糖、電泳緩沖液(上海蘭衛(wèi)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室)。

1.3 研究方法

1.3.1 運(yùn)動方式 采用吳劍[6]法，實(shí)驗(yàn)組和對照組均采用德國Ergoline 1200EL有氧功率車，方式為臥式蹬車的遞增定量負(fù)荷運(yùn)動，以起始負(fù)荷50W和60r/min的頻率開始蹬車，每3分鐘增加負(fù)荷50W，直至力竭，平臥恢復(fù)3分鐘。

1.3.2 血樣品采集 所有實(shí)驗(yàn)組和對照組均于運(yùn)動結(jié)束即時抽取外周血3m1，放置至-80℃冰箱凍存。

1.3.3 ELISA法測定血漿中兒茶酚胺含量 根據(jù)兒茶酚胺含量測定試劑盒說明書進(jìn)行操作，結(jié)果采用標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行倍比稀釋后，同法操作測定，用酶標(biāo)儀在450nm測定吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1)；各樣品同法得到的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對應(yīng)的濃度。

圖1 兒茶酚胺類物質(zhì)濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.3.4 基因操作 1.3.4.1 DNA提取 取外周靜脈全血EDTA抗凝，分離白細(xì)胞，酚/氯仿法提取基因組DNA，利用ND-1000紫外/可見分光光度計測定DNA質(zhì)量和濃度，并放置在-80℃冰箱凍存。

1.3.4.2 β1AR基因擴(kuò)增 用Primer 3.0在線軟件設(shè)計引物進(jìn)行PCR-RFLP，β1AR基因49位點(diǎn)上游引物為5’-CCUUUGTTCTUUUUTUTTCC-3’，下游引物為5’-UUCUAUUTUATUUCUA UUTAUC-3’，片段大小562bp；β1-AR基因389位點(diǎn)上游引物為5’-CATCATUUUCUTCTT CACUC-3’，下游引物為5’-TUUUCTTCUAUTTCA CCTUC-3’，片段大小547bp。PCR擴(kuò)增體系：2×Goldstar Best Master Mix 15μ1，10μM引物2μl,模板100ng，補(bǔ)充ddH2O至總體積30μ1，置ABI2720熱循環(huán)儀(美國)中，反應(yīng)條件：循環(huán)1次(99℃10min，98℃30sec),循環(huán)38次(60℃45 sec，72℃90sec)。

1.3.4.3 酶切 β-AR基因49位點(diǎn)PCR產(chǎn)物，采用NEB公司(美國)的限制性內(nèi)切酶Eco O109I在37℃下水浴中酶切8h；β-AR基因389位點(diǎn)PCR產(chǎn)物，采用NEB公司(美國)的限制性內(nèi)切酶BcgI在37℃下水浴中酶切4h。

1.3.4.4電泳 兩種酶切產(chǎn)物，各取3μ1，以100bp DNA為Marker，5%瓊脂糖凝膠電泳時間45分鐘(電壓90V)，然后在紫外線燈下顯色觀察。

1.3.4.5 進(jìn)行質(zhì)譜檢測，并收集數(shù)據(jù) 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)反應(yīng);Typer 4.0軟件檢測質(zhì)譜峰，并根據(jù)質(zhì)譜峰圖判讀各樣本目標(biāo)位點(diǎn)基因型。

1.4 運(yùn)動能力檢測

采用高炳宏[7]一口氣接一口氣法，運(yùn)用心肺功能測試儀(Cortex Biophysik，德國產(chǎn))測試，每10s連續(xù)記錄氣體代謝的各項(xiàng)指標(biāo),包括平均體重最大耗氧量(VO2max/kg)、最大二氧化碳排出量(VCO2max)、最大呼吸商(respiratory quotient，RQmax)、最大通氣量(Maximal voluntary ventilation,MVV),最大呼吸頻率(Respiratory frequency，RFmax)、最大氧脈搏(O2Plusemax),最大功率(Pmax),最大運(yùn)動時間(Tmax)、最大負(fù)荷的工作時間(Wmax-T)，并測定運(yùn)動后即刻、運(yùn)動后3min和恢復(fù)后心率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1兒茶酚胺類物質(zhì)濃度比較

實(shí)驗(yàn)組和對照組兒茶酚胺類物質(zhì)濃度比較如表2所示，運(yùn)動后腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺濃度，實(shí)驗(yàn)組均高于對照組，同性別相比，實(shí)驗(yàn)組亦均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 兒茶酚胺類物質(zhì)濃度比較表(pg/ml，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)

注：1總數(shù)相比，2男性相比 3女性相比

2.2 β1AR基因PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果

根據(jù)劉建華[1]的研究，β1AR的Ser49Gly基因多態(tài)性:Ser49Ser對應(yīng)堿基為AA，Ser49Gly對應(yīng)AG，GIy49Gly對應(yīng)GG;Arg389G1y基因多態(tài)性:Arg389Arg對應(yīng)堿基為CC，Arg389G1y對應(yīng)CG，G1y389G1y對應(yīng)GG。

圖2 β1AR基因49位點(diǎn)和389位點(diǎn)PCR-RFLP擴(kuò)增檢測結(jié)果

β1AR基因49位點(diǎn)和389位點(diǎn)PCR擴(kuò)增目的片段長分別在562bp和547bp,如圖2所示。

2.3 β1AR49和389位點(diǎn)多態(tài)性基因型分型

β1AR49基因分布為GG、AG、AA三種，而389位點(diǎn)多態(tài)性基因型分布為CC、CG和CC三種，(如圖3、4所示)。

2.4 β1AR基因49位點(diǎn)多態(tài)性

使用Eco O109I對β1AR基因49位點(diǎn)酶切可區(qū)分出3種基因型:GG型(219,343bp2條條帶)、AG型(562,343,219bp3條條帶)和AA型(562bp1條條帶)，見圖5。兩組β1AR基因49位點(diǎn)多態(tài)性分析：實(shí)驗(yàn)組和對照組均符合H-W遺傳平衡定律(P>0.05),具有群體代表性。兩組β1AR基因49位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較見表3所示，基因型GG、AG、AA分布的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，兩組等位基因G、A頻率的比較，差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 β1AR基因49位點(diǎn)基因型分布圖

圖4 β1AR基因389位點(diǎn)多態(tài)性的測序圖譜

2.5 β1AR基因389位點(diǎn)多態(tài)性

使用BcgI對β1AR基因389位點(diǎn)酶切可區(qū)分出3種基因型:GG型(547bp1條條帶)、CG型(4,171,342,547bp4條條帶)和CC型(34,171,342bp3條帶)，見圖5。兩組β1AR基因389位點(diǎn)多態(tài)性分析：實(shí)驗(yàn)組和對照組均符合H-W遺傳平衡定律(P>0.05)，具有群體代表性。兩組β1AR基因389位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較見表5所示，實(shí)驗(yàn)組基因型CC和等位基因G、C基因型頻率與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而兩組CG、GG基因型比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

*為實(shí)際數(shù)和理論數(shù)的比較

圖5 β1AR基因49和389位點(diǎn)多態(tài)性PCR-RFLP電泳結(jié)果

表4 兩組β1AR基因389位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較(n/%)

*實(shí)際數(shù)和理論數(shù)比較

2.6 血液兒茶酚胺濃度與β1AR基因多態(tài)性的關(guān)系

2.6.1 血液腎上腺素濃度與β1AR基因多態(tài)性的關(guān)系 血液腎上腺素濃度與β1AR基因多態(tài)性的關(guān)系見表5所示，實(shí)驗(yàn)組的血液腎上腺素濃度與β1AR基因389位點(diǎn)的CC明顯高于對照組，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而兩組β1AR基因49位點(diǎn)和β1AR基因389位點(diǎn)的CG、GG基因型比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

兩組中，49位點(diǎn)的AG基因型的血液腎上腺素濃度明顯高于AA型，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但與GG基因型無差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而389位點(diǎn)的CC基因型的血液腎上腺素濃度明顯高于CG型，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但與GG基因型無差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表5 血液腎上腺素濃度與β1AR基因多態(tài)性的關(guān)系

*P<0.01/0.05

2.6.2 血液去甲腎上腺素濃度與β1AR基因多態(tài)性的關(guān)系 血液去甲腎上腺素濃度與β1AR基因多態(tài)性的關(guān)系見表6所示，實(shí)驗(yàn)組的血液去甲腎上腺素濃度與β1AR基因389位點(diǎn)的CC明顯高于對照組，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而兩組β1AR基因49位點(diǎn)和β1AR基因389位點(diǎn)的CG、GG基因型比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

兩組中，49位點(diǎn)的AG基因型的血液去甲腎上腺素濃度明顯高于AA型，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但與GG基因型無差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而389位點(diǎn)的基因型的血液去甲腎上腺素濃度無差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表6 血液去甲腎上腺素濃度與β1AR基因多態(tài)性的關(guān)系

*P<0.01/0.05

2.6.3 血液多巴胺濃度與β1AR基因多態(tài)性的關(guān)系 血液多巴胺濃度與β1AR基因多態(tài)性的關(guān)系見表6所示，實(shí)驗(yàn)組的血液多巴胺濃度與β1AR基因389位點(diǎn)的CC明顯高于對照組，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而兩組β1AR基因49位點(diǎn)和β1AR基因389位點(diǎn)的CG、GG基因型比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

兩組中，49位點(diǎn)的AG基因型的血液多巴胺濃度明顯高于AA型，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但與GG基因型無差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而389位點(diǎn)的基因型的血液去甲腎上腺素濃度無差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表7 血液多巴胺濃度與β1AR基因多態(tài)性的關(guān)系

*P<0.01/0.05

2.7 有氧代謝能力指標(biāo)與β1AR基因多態(tài)性的關(guān)系

有氧代謝能力指標(biāo)與β1AR基因多態(tài)性的關(guān)系見表8-9所示，其中VO2max/kg、O2Plusemax、VCO2max、RQmax、MVV、RFmax、Tmax、Wmax-T、運(yùn)動后即刻和運(yùn)動后3min心率等指標(biāo)中實(shí)驗(yàn)組的β1AR基因389位點(diǎn)的CC明顯高于對照組，并且實(shí)驗(yàn)組的CC亦高于CG和GG組，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05/0.01)，而兩組β1AR基因49位點(diǎn)和β1AR基因389位點(diǎn)的CG、GG基因型比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而恢復(fù)后心率所有實(shí)驗(yàn)組均低于對照組，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表8 有氧代謝能力指標(biāo)與β1AR49位點(diǎn)基因多態(tài)性的關(guān)系

#與同組同位點(diǎn)CC相比P<0.05，*與實(shí)驗(yàn)組同位點(diǎn)相比P<0.01

表9 有氧代謝能力指標(biāo)與β1AR389位點(diǎn)基因多態(tài)性的關(guān)系

#與同組同位點(diǎn)CC相比P<0.05，*與實(shí)驗(yàn)組同位點(diǎn)相比P<0.01

3 討 論

在心臟功能調(diào)節(jié)中，交感神經(jīng)-腎上腺素能系統(tǒng)具有重要作用。應(yīng)激狀態(tài)時，交感神經(jīng)興奮，交感神經(jīng)節(jié)前纖維支配的腎上腺髓質(zhì)分泌大量的腎上腺素和去甲腎上腺素，進(jìn)入血液，與βAR結(jié)合。而βAR有四個亞型，包括β1-AR、β2-AR、β3-AR和β4-AR，其中β1-AR主要分布在心臟，由10號染色體短臂q24-26基因編碼，其屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，分為β1-AR、β2-AR和β3-AR三種亞型，而G蛋白系單體蛋白，N端在細(xì)胞膜外，C端在胞膜內(nèi)，其肽鏈跨膜七次，形成膜內(nèi)外的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與配體腎上腺素及去甲腎上腺素結(jié)合后，別構(gòu)激活G蛋白，基礎(chǔ)狀態(tài)下，G蛋白由結(jié)合GDP的α亞基和β、γ三個亞基構(gòu)成，當(dāng)兒茶酚胺類物質(zhì)與β1-AR結(jié)合后，則G蛋白的α亞基上原來結(jié)合GDP的位置改為與GTP結(jié)合，這時α與βγ分離，游離的結(jié)合GTP的α亞基激活腺苷酸環(huán)化酶，使ATP形成cAMP，后者再激活蛋白激酶A(PKA)，PKA能夠使L型Ca2+通道磷酸化，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，從而使心率加快、血壓上升和心肌收縮增強(qiáng)[8,9]。在本實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)動后，三種兒茶酚胺濃度實(shí)驗(yàn)組均高于對照組(P<0.05)，證明了此點(diǎn)。

β1-AR基因的rs1801252即第145位的堿基A被G替換，表現(xiàn)在蛋白質(zhì)的49位絲氨酸(Ser)被甘氨酸(Gly)所代替[1,9],經(jīng)Eco O109I酶切有GG、AG和AA型三種基因型，與劉建華[1]、石力[9]和Mason DA[10]等的研究一致，而兩組的基因型分布和等位基因頻率的比較，無差異(P>0.05)，提示β1AR基因EcoO109I多態(tài)性表達(dá)與運(yùn)動能力無關(guān)聯(lián)。

圖6 β1-AR作用機(jī)理圖

β1AR1165位C堿基突變?yōu)镚堿基，引起蛋白質(zhì)的389位精氨酸(Arg)變成了甘氨酸(Gly)突變，經(jīng)BcgI酶切有GG、CG和CC型三種基因型，亦與前者[1,9,10]研究一致，但實(shí)驗(yàn)組基因型CC和等位基因G、C基因型頻率與對照組相比，差異顯著(P<0.05)，而兩組CG、GG基因型比較無差異(P>0.05)，這與Mason DA[10]等人研究結(jié)果相仿，說明β1AR基因389位點(diǎn)位于細(xì)胞表面，特別是CC基因型和等位基因的C，細(xì)胞內(nèi)羧基末端附近，鄰近磷酸化位點(diǎn)，是G蛋自藕聯(lián)及隨后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵點(diǎn)，可能影響了β1-AR的G蛋白偶聯(lián)過程，改變了腺苷酸環(huán)化酶的活化程度，從而影響受體功能，這種改變極大地影響了心肌細(xì)胞的興奮、收縮及傳導(dǎo)功能[11]。但49位點(diǎn)的AG基因型的血液去甲腎上腺素和多巴胺濃度升高顯著，機(jī)理尚不清楚，有待進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行研究。

有氧能力是運(yùn)動的基礎(chǔ)能力，出色的有氧能力使運(yùn)動員獲得較多的營養(yǎng)物質(zhì)，增加肌肉組織獲取ATP，減少對肌組織氧化酶的抑制作用，同時，增加運(yùn)動性疲勞產(chǎn)生的5-羥色胺的排泄，減少對肌組織的抑制，促進(jìn)神經(jīng)性疲勞的恢復(fù)；同時，出色的有氧能力，能促進(jìn)運(yùn)動后堆積在神經(jīng)-肌接頭處的乙酰膽堿的排泄；最后，由于運(yùn)動造成的鈣通道控制能力降低，高氧促進(jìn)鈣通道控制能力恢復(fù)，使運(yùn)動產(chǎn)生的肌細(xì)胞膜自由基減少，使肌肉恢復(fù)正常的興奮性。這樣，運(yùn)動員出色的有氧能力利于運(yùn)動員更好地消除在訓(xùn)練或比賽中積累的疲勞，使機(jī)體能夠承受更大的負(fù)荷，提高訓(xùn)練效果[8-13]。

根據(jù)璩勝[14]的研究，VO2max/kg反映機(jī)體的有氧代謝和供能水平，而MVV反應(yīng)機(jī)體攝氧利用能力；最大氧脈搏(O2plusemax)是VO2/HR的最大值，是反映心臟每搏攝取的最大氧量，是反應(yīng)心肺功能的綜合指標(biāo)，其值越高，運(yùn)動員心肺功能越強(qiáng)，血氧飽和度就高，其是評估心臟輸氧效率高低的最佳指標(biāo)；在相同遞增負(fù)荷的運(yùn)動模型中，總運(yùn)動時間(Tmax)在最大負(fù)荷階段的運(yùn)動時間長短的不同，展示了機(jī)體運(yùn)動能力的大小和總運(yùn)動量，而最大負(fù)荷的工作時間(Wmax-T)反應(yīng)機(jī)體承受負(fù)荷的能力。本研究顯示：實(shí)驗(yàn)組CC獲氧量明顯高于對照組，并且實(shí)驗(yàn)組的CC亦高于CG和GG組，說明389位點(diǎn)的CC具有較強(qiáng)的獲氧能力，可能與CC基因型鄰近磷酸化位點(diǎn)，增強(qiáng)了腺苷酸環(huán)化酶的活化，從而促進(jìn)了心肌的興奮、收縮及傳導(dǎo)功能，增強(qiáng)了獲氧量，從而增加肌組織獲取ATP，增加運(yùn)動性疲勞物質(zhì)5-羥色胺排泄以及神經(jīng)肌接頭乙酰膽堿排泄[11]。

4 結(jié) 論

運(yùn)動后，運(yùn)動員的血液兒茶酚胺濃度升高顯著；具有β1AR的389位點(diǎn)C等位基因者，運(yùn)動能力較好，具有G等位基因者，運(yùn)動能力相對較差。

本實(shí)驗(yàn)僅研究兒茶酚胺濃度和β1AR多態(tài)性與運(yùn)動能力的相關(guān)性，但對心室肌、血管的影響是下一步研究的課題。