秦 珩，程 潔，靳蘇香，錢 雯，章 婉，嚴(yán) 婷，董 昊，張成香，張璐璐，王玉邦, ，環(huán) 飛*

(1. 江蘇省醫(yī)藥農(nóng)藥獸藥安全性評價(jià)與研究中心，南京 211166；2. 南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南京 211166)

反復(fù)接觸農(nóng)藥可能導(dǎo)致皮膚致敏反應(yīng)，皮膚出現(xiàn)紅斑、水腫、丘疹、焦痂、瘙癢等體征的變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis, ACD)。ACD是有關(guān)農(nóng)藥生產(chǎn)、使用者的健康與職業(yè)衛(wèi)生重要問題。目前評估農(nóng)藥皮膚致敏性的方法是豚鼠實(shí)驗(yàn)，主要包括豚鼠局部封閉涂皮實(shí)驗(yàn)(Buehler test, BT法)和豚鼠最大值實(shí)驗(yàn)(guinea pig maximisation test, GPMT)，但動(dòng)物使用數(shù)量多，時(shí)間長達(dá)30天，結(jié)果受主觀影響，近年來發(fā)展小鼠局部淋巴結(jié)分析實(shí)驗(yàn)(local lymph node assay，LLNA)，LLNA方法的實(shí)現(xiàn)了小動(dòng)物替代大動(dòng)物，動(dòng)物使用量減少，結(jié)果更加客觀，已被國家標(biāo)準(zhǔn)采納為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法[1]。但該方法需要使用3H或125I放射性同位素、特殊儀器以及同位素實(shí)驗(yàn)室等條件，還可能污染環(huán)境和實(shí)驗(yàn)人員暴露風(fēng)險(xiǎn)，推廣作為農(nóng)藥致敏性常規(guī)檢測相對困難。通過BrdU標(biāo)記示蹤和酶聯(lián)疫吸附(ELISA)法測定細(xì)胞增殖已被廣泛應(yīng)用各種實(shí)驗(yàn)[2-4]，本次實(shí)驗(yàn)方法采用ELISA檢測技術(shù)，提高實(shí)驗(yàn)的靈敏性，同時(shí)避免放射性同位素?fù)饺敕ǖ姆派湫晕廴?，推廣在農(nóng)藥致敏性評價(jià)中應(yīng)用靈敏、短期且無污染的安全性評價(jià)方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級、9周齡(初始體重19.8～24.8 g)、30只雌性BALB/c小鼠[5]，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供[SCXK (蘇) 2017-0007]，合格證編號：201712819。動(dòng)物飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生分析檢測中心動(dòng)物屏障設(shè)施中[SYXK (蘇) 2015-0009]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會審查的要求。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

AOO(丙酮∶橄欖油=4∶1，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司、益海嘉里食品營銷有限公司)、超純水(美國Millipo公司密理博純水儀自制)、BrdU(Sigma公司)、BrdU-ELISA試劑盒(Abcam公司)、pH 7.0無鈣鎂磷酸鹽緩沖液(PBS，HyClone)。電子天平(T1000型、常熟市雙杰測試儀器廠)，酶標(biāo)儀(SpectraMax/M2e、美谷分子儀器(上海)有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(Heracell-150、德國賀利氏公司)，超凈工作臺(SW-CJ-2FD、蘇州凈化設(shè)備有限公司)，倒置顯微鏡(CK41、日本Olympus公司)，離心機(jī)(DD-5M、上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限司)，游標(biāo)卡尺(0 ～ 150 mm、上海美耐特實(shí)業(yè)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組與染毒

將30只BALB/c小鼠，隨機(jī)分為6組，每組5只。氰氟草酯乳油設(shè)3個(gè)(100%、50%、25%)濃度組，受試樣品采用橄欖油稀釋，采用同時(shí)設(shè)陰性對照組(橄欖油)、設(shè)陰性對照組(AOO)及陽性對照組(25%已基肉桂醛，采用AOO溶解)。小鼠耳背涂抹25 μL受試物，每天1次給樣，連續(xù)3 d，第6天給小鼠腹腔注射BrdU(溶劑PBS，5 mg/只)，24 h后處死小鼠。

1.3.2 耳厚測定

記錄實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)的耳厚度。

1.3.3 耳重測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束采用打孔器取下直徑8 mm耳片，稱重。

1.3.4 淋巴結(jié)重量與細(xì)胞懸液的制備

取雙側(cè)耳后淋巴結(jié)并稱重；200目篩網(wǎng)研磨制備單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15 mLPBS。

1.3.5 Brdu-ELISA測定

將100 μL細(xì)胞懸液加入到平底96孔板，每只動(dòng)物3個(gè)平行孔。1200 r/min離心10 min，棄上清后烘干培養(yǎng)板，每孔加入固定液200 μL，室溫固定30 min后離心棄固定液，加入anti-BrdU抗體溶液100 μL，室溫孵育1 h后離心棄抗體溶液，加入洗滌液200 μL清洗抗體溶液，離心棄洗滌液，清洗3次，加入TMB底物溶液100 μL，常溫、避光孵育15 min，酶標(biāo)儀波長450 nm，測量吸光度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)算刺激指數(shù)(SI)：SI1為實(shí)驗(yàn)組淋巴結(jié)重量平均值與對照組淋巴結(jié)重量平均值的比值；SI2為實(shí)驗(yàn)組發(fā)(吸)光值平均值與對照組發(fā)(吸)光值平均值的比值。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0計(jì)算均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差，小鼠體重采用多組間比較用單因素方差分析，組間比較及多組與對照組比較用Dunnett-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 體重

結(jié)果顯示各劑量組各觀察點(diǎn)的小鼠體重與對照組比較，差異均無顯著性(P> 0.05)(未列圖表)。

2.2 耳厚度和耳重

結(jié)果顯示，各劑量組的耳染毒區(qū)未觀察到明顯紅斑、水腫，耳厚度增加和耳重均不超過對照組的25%。

2.3 淋巴結(jié)重量

由表1結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組和陽性對照組的淋巴結(jié)重量變化情況，溶劑和空白對照組的刺激指數(shù)SI1<1.6，陽性對照組(25%肉桂醛)的刺激指數(shù)SI1>1.6，實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可靠；25%氰氟草酯乳油低、中、高劑量組的刺激指數(shù)SI1<1.6，無劑量反應(yīng)關(guān)系。

2.4 BrdU含量測定

由表1結(jié)果可見，實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組和陽性對照組的BrdU含量變化情況，溶劑和空白對照組的刺激指數(shù)SI2<1.6，陽性對照組(25%肉桂醛)的刺激指數(shù)SI2>1.6，實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可靠；25%氰氟草酯乳油低、中、高劑量組的刺激指數(shù)SI2<1.6，無劑量反應(yīng)關(guān)系。

3 討論

2009年劉珍等[6]對實(shí)驗(yàn)方法改進(jìn)，增加刺激指標(biāo)如耳厚和耳重的檢測，2010年OECD增加了LLNA：BrdU-ELISA(TG442B)通過ELISA方法測定淋巴細(xì)胞增殖情況替代放射性同素的檢測[7]。2013年陽曉燕等增加了刺激指標(biāo)(耳厚差、耳重)，致敏性指標(biāo)(淋巴結(jié)重量，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，ATP與熒光素反應(yīng)后的發(fā)光強(qiáng)度)[8]。本次實(shí)驗(yàn)我們也相應(yīng)增加刺激指標(biāo)與致敏性指標(biāo)，有利于更好判斷是農(nóng)藥直接作用造成的刺激反應(yīng)，還是變態(tài)反應(yīng)。并通過定量測定小鼠引流淋巴結(jié)細(xì)胞的BrdU摻入量，分析小鼠耳部皮膚局部涂抹農(nóng)藥后，相應(yīng)耳后引流淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞的增殖情況判定農(nóng)藥致敏性。本方法的25%氰氟草酯乳油致敏性結(jié)果SI1和SI2均小于1.6，結(jié)果為陰性，與本實(shí)驗(yàn)室的采用傳統(tǒng)方法檢測的結(jié)果一致。

小鼠局部淋巴結(jié)(BrdU摻入法)實(shí)驗(yàn)是用小鼠替代豚鼠的實(shí)驗(yàn)方法，每組最少可以使用4只小鼠，明顯減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量；并以體積小的動(dòng)物代替體積大的動(dòng)物；并且實(shí)驗(yàn)周期僅7 d時(shí)間，大量節(jié)約動(dòng)物設(shè)施的使用面積、時(shí)間、耗能；改進(jìn)了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測量方法，酶標(biāo)儀定量檢測使結(jié)果更加客觀科學(xué)，避免傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)肉眼觀察皮膚反應(yīng)評分帶來的主觀性，實(shí)現(xiàn)了3R原則(減少、優(yōu)化與替代)[9]。2010 年替代方法驗(yàn)證多機(jī)構(gòu)協(xié)調(diào)委員會(ICCVAM)采納LLNA：BrdU-ELISA作為皮膚致敏性的替代方法[10]。冼靜雯[11]等采用BALB/c小鼠 LLNA:BrdU-ELISA對多種化學(xué)物研究表明，該法陽性預(yù)測率為 90%、陰性預(yù)測率為 100%、假陽性率為 17%、假陰性率為 0、靈敏度為 100%、特異度為 83%、準(zhǔn)確度為 93%。因此，高靈敏度，省時(shí)，省力，費(fèi)用低的LLNA：BrdU ELISA有必要在我國農(nóng)藥致敏性常規(guī)檢測領(lǐng)域推廣。

表1 淋巴結(jié)重量與BrdU的測定結(jié)果Table 1 Determination of lymph node weight and BrdU staining