黃樹(shù)武，王 靜，陳梅玲，羅銀珠，潘金春，吳瑞可，何麗芳，閔凡貴

(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510663)

非人靈長(zhǎng)類(non-human primates)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是生物醫(yī)學(xué)研究中不可替代的重要資源，被廣泛應(yīng)用于人類疾病的模型研究、疫苗與藥物的臨床前評(píng)價(jià)[1-3]，是研究HIV感染、免疫和病理的首選動(dòng)物模型[4-7]。隨著非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)繁育規(guī)范化程度提高及動(dòng)物福利的不斷加強(qiáng)，非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)化程度也越來(lái)越高。

在生物醫(yī)學(xué)研究工作中，使用量最多的非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是舊大陸猴，其中以恒河猴和食蟹猴為主。早期研究報(bào)告分別對(duì)恒河猴和食蟹猴之間關(guān)于血液生理和生化指標(biāo)[8-9]、紅細(xì)胞免疫黏附功能[10]、血液蛋白遺傳多樣性[11]、生產(chǎn)繁殖性能[12-13]等生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定和分析，獲得了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，證實(shí)恒河猴與食蟹猴雖然存在某些參數(shù)的差異，但總體種屬差異性不大。然而，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)關(guān)于正常食蟹猴與恒河猴細(xì)胞因子比較的報(bào)道，國(guó)外也鮮有報(bào)道。本研究將采用高通量xMap技術(shù)測(cè)定恒河猴與食蟹猴血清多重細(xì)胞因子的濃度，并分析恒河猴與食蟹猴間差異，為生物醫(yī)學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

表1 選擇的因子信息Table 1 Information of the selected cytokines

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)恒河猴15只，年齡3.0～4.0歲，其中雄性7只，體重5.0～6.0 kg，雌性8只，體重4.3～5.5 kg，由從化華珍實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供[SCXK (粵) 2015-0028]，結(jié)核菌素試驗(yàn)陰性，排除猴B病毒、猴免疫缺陷病毒、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒和猴T淋巴細(xì)胞趨向性病毒I 型。該機(jī)構(gòu)獲得了國(guó)際AAALAC完全認(rèn)證，其動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作在從化華珍實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)施[SYXK (粵) 2015-0151]，符合動(dòng)物福利和倫理要求，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

普通級(jí)食蟹猴15只，年齡3.0～4.0歲，其中雄性7只，體重3.5～4.5 kg，雌性8只，體重2.5～3.5 kg，由廣東春盛生物科技有限公司提供[SCXK (粵) 2014-0027]，結(jié)核菌素試驗(yàn)陰性，排除猴B病毒、猴免疫缺陷病毒、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒和猴T淋巴細(xì)胞趨向性病毒I 型。該機(jī)構(gòu)獲得了國(guó)際AAALAC完全認(rèn)證，其動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作在廣東春盛生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)設(shè)施[SYXK (粵) 2015-0152]，符合動(dòng)物福利和倫理要求，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

液相芯片，由R&D Systems生產(chǎn)，包括2個(gè)反應(yīng)體系，體系1同時(shí)測(cè)定37種細(xì)胞因子(Lot Number: L122018)，體系2同時(shí)測(cè)定6種細(xì)胞因子(Lot Number: L122016)，具體信息見(jiàn)表1。流式細(xì)胞儀(BD/FACSCanto 2，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血清采集

采用非抗凝真空采血管自后肢小隱靜脈或前肢皮下頭靜脈采集血液1～2 mL，4℃冰箱過(guò)夜，3000 r/min離心15 min，取上清液，-80℃條件保存。

1.3.2 細(xì)胞因子檢測(cè)

利用流式細(xì)胞儀(BD/FACSCanto 2，美國(guó))，采用xMap技術(shù)測(cè)定血清中43種細(xì)胞因子的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞因子檢測(cè)分析

所測(cè)29種細(xì)胞因子按其在感染免疫中的作用，可分為促炎癥因子、抑炎癥因子、多能細(xì)胞因子和其他功能細(xì)胞因子，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。其中，19種細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果呈正態(tài)分布，F(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果顯示有2種細(xì)胞因子方差不齊；10種細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果呈偏態(tài)分布。

恒河猴與食蟹猴比較，11種促炎癥因子中，僅IL-15存在顯著性差異(P﹤0.05)；12種抑炎癥因子中，3種細(xì)胞因子(IL-1RA、IL-6R α和sCD27)存在顯著性群體間差異(P﹤0.05)；其他細(xì)胞因子無(wú)群體間差異(P﹥0.05)。

2.2 趨化因子檢測(cè)分析

14種趨化因子的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，其中，11種趨化因子呈正態(tài)分布，1種趨化因子F檢驗(yàn)結(jié)果顯示方差不齊；3種趨化因子呈偏態(tài)分布。

恒河猴與食蟹猴比較，僅CCL5/RNATES存在群體間差異(P﹤0.05)。

3 討論

細(xì)胞因子具有極強(qiáng)的生物學(xué)活性，在生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要的意義[14-16]，一方面，可作為藥物用于臨床許多疾病的治療，另一方面，細(xì)胞因子在體內(nèi)具有重要的病理作用。在感染、炎癥、自身免疫病、免疫缺陷疾病等狀態(tài)下，部分細(xì)胞因子明顯變化，通過(guò)檢測(cè)血清、血漿或組織液中細(xì)胞因子含量，可以對(duì)疾病診斷和治療做出相應(yīng)評(píng)價(jià)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。而基礎(chǔ)血清、血漿和組織液中細(xì)胞因子的水平成為衡量病理狀態(tài)下細(xì)胞因子變化的重要的參考值，是首當(dāng)其沖要解決的問(wèn)題。

盡管實(shí)驗(yàn)猴的使用數(shù)量越來(lái)越多，應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，但是其基礎(chǔ)生物學(xué)特性數(shù)據(jù)的研究卻相對(duì)滯后，作為實(shí)驗(yàn)猴生產(chǎn)和出口大國(guó)，目前，我國(guó)尚無(wú)關(guān)于恒河猴與食蟹猴基礎(chǔ)細(xì)胞因子水平的研究。本研究采用高通量luminex xMap技術(shù)測(cè)定了恒河猴與食蟹猴43種血清細(xì)胞因子的水平，并進(jìn)行了群體間比較。結(jié)果顯示，恒河猴與食蟹猴間僅5種細(xì)胞因子存在顯著性群體間差異，表明兩種猴群體間差異不大。本研究選擇的43種細(xì)胞因子與感染免疫、腫瘤免疫及自身免疫性疾病相關(guān)，提示恒河猴與食蟹猴具有相似的免疫基礎(chǔ)，基于兩種實(shí)驗(yàn)猴開(kāi)展免疫研究具備較高的可比性。

表2 細(xì)胞因子濃度測(cè)定結(jié)果及比較分析Table 2 Concentrations of detected cytokines and analysis of inter-group differences

備注： *采用Mann-Whitney test，△采用矯正t檢驗(yàn)，其他參數(shù)采用隨機(jī)t檢驗(yàn).
Note. *Mann-WhitneyU-test.△Adjustedt-test. Other parameters used the randomt-test.

表3 趨化因子濃度測(cè)定結(jié)果及比較分析Table 3 Concentrations of detected chemokines and analysis of inter-group differences

備注：*采用Mann-Whitney test，△采用矯正t檢驗(yàn)，其他參數(shù)采用隨機(jī)t檢驗(yàn).
Note. *Mann-WhitneyU-test.△Adjustedt-test. Other parameters used the randomt-test.

綜上，本研究探討了恒河猴與食蟹猴血清多重細(xì)胞因子水平，證實(shí)兩種猴基礎(chǔ)細(xì)胞因子水平差異小，可為生物醫(yī)學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，彌補(bǔ)現(xiàn)有資料的不足。