李靜 梁亞萍 王卓 陳基平 王智存 仵倩紅

近年來，全球耐藥結(jié)核病的發(fā)病率呈上升態(tài)勢，已嚴(yán)重威脅著人類的身體健康，成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)問題。WHO估算2017年全球新發(fā)利福平耐藥結(jié)核病(resistant to rifampicin,RR-TB)患者55.8萬例，其中82%為耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)，而且印度(24%)、中國(13%)和俄羅斯(10%)3個(gè)國家的MDR/RR-TB發(fā)病例數(shù)約占全球MDR/RR-TB總例數(shù)的50%，我國對利福平的耐藥率也依然位居全球第二[1-2]。由于耐藥結(jié)核病主要原因是濫用抗生素和不規(guī)范抗結(jié)核藥物引起[3-4]，因此合理的臨床治療對于控制耐藥結(jié)核病極為重要；而快速、準(zhǔn)確的藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)是制定合理有效的個(gè)體化抗結(jié)核化療方案的關(guān)鍵[5-7]。

目前，結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測主要采用羅氏培養(yǎng)基比例法(簡稱“L-J法”)作為耐藥結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，而BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960法”)作為與比例法檢測意義相當(dāng)?shù)闹匾椒?，可以快速培養(yǎng)及診斷耐藥結(jié)核病。微孔板法(最低抑菌濃度法)是在液體培養(yǎng)基礎(chǔ)上建立的快速、經(jīng)濟(jì)的方法[8]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，目前已有較多該領(lǐng)域的新方法在結(jié)核病耐藥性檢測方面廣泛應(yīng)用，如GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)技術(shù)、PCR-探針熔解曲線法、基因芯片法和DNA測序等技術(shù)手段[9]，且將利福平耐藥檢測作為耐多藥檢測的重要指標(biāo)[10-11]。為進(jìn)一步了解分子檢測技術(shù)和培養(yǎng)法耐藥性檢測是否存在差異，本研究以MGIT 960法耐藥性檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，探討微孔板法和GeneXpert技術(shù)對利福平耐藥性檢測的效能，為耐藥結(jié)核病檢測技術(shù)的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

材料和方法

1.標(biāo)本來源：收集陜西省結(jié)核病防治院2017年收住入院和門診診治的疑似結(jié)核病患者6893例，按照臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為結(jié)核病患者6086例，納入同時(shí)使用MGIT 960法和GeneXpert技術(shù)檢測上述確診患者的425份臨床標(biāo)本；其中，痰標(biāo)本217份、肺泡灌洗液標(biāo)本170份、肺外標(biāo)本(包括胸腹腔積液、膿液及腦脊液等)38份；排除3例報(bào)告錯(cuò)誤或無法判讀、2例培養(yǎng)結(jié)果污染的標(biāo)本，有效標(biāo)本為420份。420份標(biāo)本中372份行GeneXpert法和MGIT 960檢測結(jié)核分枝桿菌均為陽性，對其臨床分離株同時(shí)采用微孔板法、GeneXpert技術(shù)和MGIT 960法進(jìn)行耐藥性檢測；包括痰標(biāo)本191例、肺泡灌洗液標(biāo)本158例、肺外標(biāo)本(含胸腹腔積液、膿液及腦脊液等)23例(表1)。結(jié)核分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病室提供。

2.結(jié)核病診斷依據(jù)：參照《WS 288—2008肺結(jié)核診斷》標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)患者典型結(jié)核病臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢測、胸部X線攝影表現(xiàn)，以及最終診斷性抗結(jié)核藥物治療有效進(jìn)行臨床確診。以下任意一條均可確診為結(jié)核病：(1)各項(xiàng)標(biāo)本抗酸桿菌涂片鏡檢陽性2次或查抗酸桿菌陽性1次且結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性；(2)影像學(xué)檢查結(jié)果支持肺結(jié)核，同時(shí)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性；(3)影像學(xué)檢查結(jié)果支持肺結(jié)核，同時(shí)結(jié)核分枝桿菌核酸檢測陽性等。

表1 GeneXpert法和MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果在各檢測標(biāo)本中的分布

注“肺外標(biāo)本”包括胸腹腔積液、膿液及腦脊液等；有效標(biāo)本420份，排除2例培養(yǎng)污染的痰標(biāo)本和3例報(bào)告錯(cuò)誤或無法判斷的肺外標(biāo)本

3.主要試劑和儀器設(shè)備：MGIT 960法檢測所用的培養(yǎng)儀及試劑均由美國BD公司提供；微孔板法(分枝桿菌藥敏檢測試劑盒)由珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司提供，多通道渦旋振蕩器、YK-90小型全自動移液平臺、YK-909分枝桿菌藥敏閱讀儀均由珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司提供；GeneXpert技術(shù)反應(yīng)盒及樣品試劑均購自美國Cepheid公司。

4.MGIT 960法耐藥性檢測：向利福平藥瓶中加4 ml蒸餾水復(fù)溶藥液，將MGIT 960法培養(yǎng)陽性5 d內(nèi)的菌液稀釋5倍后作為工作菌液，用記號筆分別在MGIT培養(yǎng)管標(biāo)簽空白處標(biāo)記生長對照管及利福平管。然后向每個(gè)培養(yǎng)管中加入0.8 ml營養(yǎng)添加劑，向標(biāo)記“利福平”的管中加入0.1 ml利福平藥液及0.5 ml工作菌液，生長對照管內(nèi)加入0.5 ml 按照1∶100稀釋后的工作菌液，擰緊管蓋，輕輕顛倒數(shù)次混勻。掃描藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)架條形碼，按指示燈位置放入孵育箱孵育，等待儀器自動報(bào)告結(jié)果。儀器將打印藥敏試驗(yàn)結(jié)果定性為敏感(S)、耐藥(R)或不確定(X)。

5.微孔板法耐藥性試驗(yàn)：將無菌稀釋液全部(3 ml)加入凍干雜菌抑制劑中，充分搖勻，吸取100 μl加入藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基中，并充分混合均勻。分別吸取180 μl藥敏試驗(yàn)液體培養(yǎng)基加入A1/E1和B1/F1孔中，其中A1/E1孔作為1/10參照孔(陽性對照孔1)、B1/F1孔作為1/100參照孔(陽性對照孔2)，再吸取200 μl藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基加入到C1、D1孔或G1、H1孔作為陰性對照。將結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌株(經(jīng)MGIT 960培養(yǎng)陽性的新鮮菌株)置于離心管中3500×g離心3～5 min，取適量離心沉淀菌株加入到磨菌管里，將其放到Y(jié)K-50多通道快速混勻器上2500 r振蕩2 min，磨菌30～45 s后靜置10～15 min，取上層均勻菌懸液用無菌生理鹽水比濁至1 mg/ml，最后吸取100 μl制備好的菌懸液(1 mg/ml)加至藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基(10 ml)中，顛倒混勻。在96孔藥敏試驗(yàn)板中每孔加200 μl含菌懸液的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基(除外上述4個(gè)陰性對照孔)，再吸20 μl到A1/E1孔作為1/10參照孔，最后從A1/E1孔吸20 μl至B1/F1作為1/100參照孔。上述步驟使用YK-96小型全自動移液平臺進(jìn)行自動加樣。蓋上盒蓋密封后置37 ℃培養(yǎng)7～14 d后觀察結(jié)果。

微孔板法藥敏試驗(yàn)結(jié)果讀?。簩?6孔 U形板放置于YK-909分枝桿菌藥敏試驗(yàn)閱讀儀上進(jìn)行觀察并記錄結(jié)果?；蛘呤褂萌庋塾^察時(shí)，將藥敏試驗(yàn)板置于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)孔底出現(xiàn)肉眼可見的白色菌體沉淀則為陽性，無肉眼可見菌體沉淀的為陰性；定義孔底可見白色菌體沉淀在大于1/100 和小于1/10對照孔的最低藥物濃度(在藥敏試驗(yàn)區(qū)為防止一些拖尾的現(xiàn)象，設(shè)定的兩個(gè)參照孔)。按試劑盒說明書報(bào)告對利福平的藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

6. GeneXpert技術(shù)檢測：取1 ml標(biāo)本加入前處理管中，視樣本性狀加入2倍標(biāo)本體積樣本處理液(氫氧化鈉和異丙醇)，渦旋振蕩 15～30 s，靜置15 min。打開反應(yīng)盒，吸取2 ml處理后樣本緩慢加入反應(yīng)盒，然后將反應(yīng)盒放人檢測模塊，儀器開始進(jìn)行自動化檢測。反應(yīng)結(jié)束后，在檢測系統(tǒng)窗口下可直接觀察測試結(jié)果。當(dāng)檢測到結(jié)核分枝桿菌目標(biāo)DNA(陽性)時(shí)，即顯示利福平耐藥性檢測結(jié)果：儀器報(bào)告為“未檢測到利福平耐藥”、“利福平耐藥” 或“利福平耐藥不確定”。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：以MGIT 960法耐藥性檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，采用SPSS 22.0軟件對GeneXpert技術(shù)和微孔板法檢測結(jié)果進(jìn)行效能及一致性檢驗(yàn)評價(jià)，并對GeneXpert技術(shù)和微孔板法的檢測效能進(jìn)行McNemar檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Kappa值判定標(biāo)準(zhǔn)：Kappa≤0為一致性極差；0

相關(guān)公式：敏感度=a/(a+b)×100%；特異度=d/(c+d)×100%；符合率=(a+d)/(a+b+c+d)×100%；Kappa=(Po-Pe)/(1-Pe)；其中，Po=(a+d)/n；Pe=(a+b)×(a+c)×(c+d)×(b+d)/n2。以上公式中，a、b、c、d分別表示為真陽性、假陰性、假陽性、真陽性例數(shù)，n為總例數(shù)。

結(jié) 果

1.不同檢測技術(shù)對利福平耐藥的檢出率：3種檢測技術(shù)在不同標(biāo)本中對利福平耐藥的總檢出率情況見表2。

2.以MGIT 960法耐藥性檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，評價(jià)其他2種檢測技術(shù)對利福平耐藥的檢出效能：以MGIT 960法耐藥性檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，微孔板法和GeneXpert技術(shù)對利福平耐藥性檢測的敏感度、特異度、符合率和Kappa值分別為91.9%(57/62)、98.4%(305/310)、97.3%(362/372)、0.8；96.8%(60/62)、96.8%(300/310)、96.8%(360/372)、0.8。Kappa值均在0.8

3. 以MGIT 960法耐藥性檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，評價(jià)其他2種檢測技術(shù)在不同臨床標(biāo)本中對利福平耐藥性檢測效能的比較：以MGIT 960法耐藥性檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，微孔板法和GeneXpert技術(shù)在不同臨床標(biāo)本中對利福平耐藥性檢測的效能見表4～6。結(jié)果2種檢測技術(shù)與MGIT 960法檢測的Kappa檢驗(yàn)結(jié)果在0.8

表2 3種檢測技術(shù)對不同標(biāo)本利福平耐藥性檢測的情況

注每份標(biāo)本均來自于1例患者；“肺外標(biāo)本”包括胸腹腔積液、膿液及腦脊液等

表3 以MGIT 960法檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)微孔板法和GeneXpert技術(shù)對利福平耐藥性檢測的效能

注敏感度=a/(a+b)×100%；特異度=d/(c+d)×100%；符合率=(a+d)/(a+b+c+d)×100%。Kappa=(Po-Pe)/(1-Pe)，其中Po=(a+d)/n，Pe=(a+b)×(a+c)×(c+d)×(b+d)/n2。以上公式中，a、b、c、d分別表示為真陽性、假陰性、假陽性、真陽性例數(shù)，n為總例數(shù)

表4 以MGIT 960法檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)微孔板法和GeneXpert技術(shù)對痰標(biāo)本中利福平耐藥性檢測的效能

注表中括號內(nèi)數(shù)據(jù)按照表3“注”中各指標(biāo)的計(jì)算公式得出

表5 以MGIT 960法檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)微孔板法和GeneXpert技術(shù)對肺泡灌洗液標(biāo)本中利福平耐藥性檢測的效能

注表中括號內(nèi)數(shù)據(jù)按照表3“注”中各指標(biāo)的計(jì)算公式得出

表6 以MGIT 960法檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)微孔板法和GeneXpert技術(shù)對肺外標(biāo)本中利福平耐藥性檢測的效能

注表中括號內(nèi)數(shù)據(jù)按照表3“注”中各指標(biāo)的計(jì)算公式得出

討 論

快速、準(zhǔn)確的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)是耐藥結(jié)核病防控的首要條件。然而，目前表型藥敏試驗(yàn)(如L-J法、MGIT 960法)及各分子診斷方法(如GeneXpert技術(shù)、分枝桿菌的DNA測序等)檢測結(jié)果的不一致性是各實(shí)驗(yàn)室必須面對的問題。國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道顯示，肺內(nèi)外結(jié)核一線抗結(jié)核藥物耐藥性檢測結(jié)果的一致率常常處于一個(gè)偏低的水平[12-14]。近幾年，由于將利福平藥敏試驗(yàn)的結(jié)果作為評價(jià)是否為MDR-TB的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)，使得對利福平的藥敏試驗(yàn)越來越受到重視。

本研究結(jié)果顯示，GeneXpert技術(shù)對結(jié)核病的總耐藥檢出率并沒有較微孔板法明顯提高，GeneXpert技術(shù)、微孔板法和MGIT 960對RFP耐藥性檢測總的陽性率分別為18.8%(70/372)、16.7%(62/372)、16.7%(62/372)，GeneXpert技術(shù)、微孔板法和MGIT 960利福平耐藥性檢測的陽性率比較相近，與楊建等[15]的調(diào)查研究結(jié)果(14.4%)相近，提示2013—2015年陜西地區(qū)結(jié)核分枝桿菌對利福平的耐藥率仍維持在一個(gè)較高的水平；但略高于2017年張?zhí)烊A等[16]報(bào)道的利福平耐藥率為15.3%，表明西北地區(qū)的MDR-TB疫情依舊比較嚴(yán)重。

本研究中GeneXpert技術(shù)和微孔板法耐藥性檢測結(jié)果顯示，兩種方法對利福平耐藥檢測的敏感度、特異度、符合率均超過90%，Kappa檢驗(yàn)結(jié)果在0.8

雖然GeneXpert技術(shù)檢測方便、快速(約需2 h)、準(zhǔn)確，但其只能檢測利福平的耐藥性，不能及時(shí)準(zhǔn)確診斷MDR-TB，不利于耐異煙肼而不耐利福平患者的治療，并可能在一定程度上影響患者的治療效果[17]，而且該檢測設(shè)備和價(jià)格相對較昂貴，不利于在地級醫(yī)院推廣應(yīng)用。另外，在結(jié)核病致死率方面的研究顯示，利用GeneXpert技術(shù)早期診斷結(jié)核病對患者的預(yù)后及病死率也沒有顯著影響；Calligaro 等[18]研究了2309例重癥監(jiān)護(hù)病房患者中疑似并發(fā)肺結(jié)核的341例患者，發(fā)現(xiàn)患者28 d和90 d 的病死率與是否利用GeneXpert技術(shù)早期診斷結(jié)核病均沒有關(guān)聯(lián)，提示即使沒有GeneXpert技術(shù)進(jìn)行早期診斷結(jié)核病，臨床醫(yī)生通常也會根據(jù)患者的臨床癥狀、其他輔助診斷方法而早期啟動診斷性抗結(jié)核藥物治療。

MGIT 960耐藥性檢測是目前國內(nèi)推廣應(yīng)用較多的一種檢驗(yàn)方法，該方法整體操作較嚴(yán)格，可在7～14 d獲得5種一線抗結(jié)核藥物的耐藥性檢測結(jié)果；其檢測儀器對多個(gè)耐藥性結(jié)果自動化處理、多次分析，造成檢測技術(shù)較依賴儀器。而且檢測設(shè)備及價(jià)格也較昂貴，也不利于在地級醫(yī)院進(jìn)行推廣和應(yīng)用。

微孔板法是“十一五”重大專項(xiàng)科研轉(zhuǎn)化成果的新型快速藥敏檢測方法[19-21]，可在培養(yǎng)7～14 d后同時(shí)獲得4種一線和12種二線抗結(jié)核藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，較MGIT 960耐藥性檢測價(jià)格便宜、操作簡單、同時(shí)獲得更多二線藥物的耐藥性信息；相比于傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)檢測方法更快速、操作更簡單，有利于早期診斷和治療MDR-TB及廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)[22]。WHO也建議，在GeneXpert技術(shù)檢測出利福平耐藥后，在進(jìn)行藥敏試驗(yàn)驗(yàn)證該耐藥結(jié)果的同時(shí)，可及時(shí)進(jìn)行抗結(jié)核藥物治療[23]。因此，綜合考慮臨床應(yīng)用及經(jīng)濟(jì)費(fèi)用等實(shí)際問題，微孔板法可作為對GeneXpert技術(shù)耐藥性檢測的一個(gè)重要補(bǔ)充。但需要注意，本研究檢測過程發(fā)現(xiàn)使用微孔板法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)時(shí)，菌量的控制及菌體自身的活性情況是整個(gè)檢測過程的關(guān)鍵因素，菌量太多會影響最后的結(jié)果觀察，菌量太少會造成結(jié)核分枝桿菌生長時(shí)間過長，導(dǎo)致整個(gè)檢測時(shí)間增加、延長檢測周期，且在微量使用過程中，需保持整個(gè)操作環(huán)境的潔凈無菌[24-25]。

在對利福平的耐藥機(jī)制中，一種觀點(diǎn)認(rèn)為基因突變導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥。有研究認(rèn)為，rpoB基因核酸序列存在突變的研究表明，對利福平耐藥大多與rpoB基因突變相關(guān)，且對利福平耐藥患者常伴隨對異煙肼耐藥[26]。本研究針對rpoB基因RRDR 中的81 bp設(shè)計(jì)5對引物、探針進(jìn)行檢測，采用GeneXpert技術(shù)檢測其是否發(fā)生突變，進(jìn)而用于診斷患者是否為結(jié)核感染，以及是否對利福平耐藥。另一種觀點(diǎn)認(rèn)為是結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁滲透性的改變導(dǎo)致了藥物攝入量減少，造成了對利福平耐藥。由于微孔板法為體外細(xì)菌培養(yǎng)，可能與該觀點(diǎn)一致，但也有可能是基因突變的位點(diǎn)沒有檢測到所致。

本研究也存在一些不足。其一，未對一些使用GeneXpert技術(shù)檢測為突變基因而微孔板法檢測為敏感的菌株進(jìn)行進(jìn)一步分析處理，主要考慮到不一致的樣本份數(shù)比較少，很難說明檢測的結(jié)果更支持哪一種方法[27]。其二，也沒有對GeneXpert技術(shù)檢測為不存在突變基因、而微孔板法檢測為耐藥的菌株進(jìn)行菌種鑒定，考慮兩者出現(xiàn)的樣本份數(shù)較少，同時(shí)也難有復(fù)測的可能性，故未進(jìn)行進(jìn)一步分析。希望成為后續(xù)研究中的一個(gè)重點(diǎn)方向。

綜上所述，GeneXpert技術(shù)雖然可以早期快速、準(zhǔn)確地篩查及檢測對利福平是否耐藥，但由于設(shè)備昂貴、僅能檢測對利福平是否耐藥，針對我國結(jié)核病高負(fù)擔(dān)的現(xiàn)狀，認(rèn)為其不利于進(jìn)行推廣應(yīng)用。而微孔板法憑借其簡便、快速、準(zhǔn)確、價(jià)廉等優(yōu)勢在國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用，但其對實(shí)驗(yàn)操作人員的水平要求較高，且存在較高污染率等問題，需要操作者規(guī)范執(zhí)行每一步實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，同時(shí)要求操作環(huán)境應(yīng)有較高的生物安全防范和設(shè)施，故認(rèn)為在臨床上可以將其作為GeneXpert技術(shù)的有效補(bǔ)充。此外，探尋更為經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的耐藥性檢測技術(shù)與方法是接下來需要深入研究的重要問題。