曹志華 趙悅竹 胡雙雙

結(jié)核病是全球范圍內(nèi)一種重要的傳染病，嚴重危害著人類的生命健康[1]。隨著抗結(jié)核藥物的廣泛使用，耐藥結(jié)核病患者逐漸增加，給結(jié)核病的預防和治療帶來重大的挑戰(zhàn)[2-3]。耐多藥結(jié)核病(multidrug resistant tuberculosis, MDR-TB)[4]即至少同時對異煙肼(INH)和利福平(RFP)兩種一線抗結(jié)核藥物產(chǎn)生耐藥的結(jié)核病，具有治療成本高、周期長、治愈率低等特點[4-5]，所以，需要準確診斷和治療才能有效預防廣泛流行[6-8]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織建議，結(jié)核病治療方案中至少應包含MTB對其不具有耐藥性的4種有效藥物，這樣能顯著提高結(jié)核病患者的治愈率[1]。但是，在我國大部分結(jié)核病患者沒有進行耐藥性檢測，導致治療存在較大盲目性[6]。目前，臨床常用的MTB藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)存在耗時費力，操作繁瑣，受人為因素影響較大，標準不統(tǒng)一等缺點[9-10]。因此，急切需要一種準確且快速檢測多種抗結(jié)核藥物是否耐藥的方法，從而在臨床上能有效指導醫(yī)生對患者用藥[11-13]。近年來，基于基因水平的診斷方法進行MTB耐藥性檢測的研究主要是針對RFP、INH兩種一線抗結(jié)核藥物，得到的耐藥信息有限[12-17]。本研究運用熒光PCR 探針熔解曲線法來檢測MTB對RFP、INH、乙胺丁醇(EMB)、鏈霉素(Sm) 4種一線抗結(jié)核藥物以及氟喹諾酮(FQ)類藥物的耐藥突變，與金標準比例法藥敏試驗進行對比，以評價該方法檢測耐藥結(jié)核病的臨床應用價值。

資料和方法

一、標本來源

收集2018年1—8月分離自遼寧省撫順市第四人民醫(yī)院門診患者的155株MTB臨床分離株，經(jīng)對硝基苯甲酸(PNB)生長試驗鑒定，153株為MTB，2株為非MTB。

二、 試劑與儀器

RFP、INH、EMB、Sm、左氧氟沙星(Lfx)和PNB含藥培養(yǎng)基(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；4% NaOH溶液；熒光PCR 探針熔解曲線法檢測試劑：MTB對RFP、INH、EMB、Sm和FQ耐藥突變檢測試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)；SLAN-96S型實時熒光定量PCR儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司)；BY-R18型低溫高速離心機(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)。

三、固體培養(yǎng)及比例法藥敏試驗

按照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[18]進行簡單法分枝桿菌固體培養(yǎng)(簡稱“固體培養(yǎng)”)：用移液槍吸取1～2 ml標本至離心管中，加入1～2倍的4% NaOH溶液進行前處理，振蕩至痰標本液化，室溫靜置15 min，將前處理后的痰標本均勻接種至酸性羅氏培養(yǎng)基斜面上，置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃孵育4～8周，最后肉眼判定：若無菌落生長則報告培養(yǎng)陰性；若出現(xiàn)不透明淡黃色、粗糙、干燥、凸起于培養(yǎng)基、或呈菜花樣，則報告培養(yǎng)陽性；若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基液化或者生長真菌，則報告污染。

培養(yǎng)結(jié)果為陽性者經(jīng)PNB生長試驗鑒定為MTB復合群后，再進行比例法藥敏試驗：在磨菌瓶中加入1～2滴10%吐溫-80水溶液，用接種環(huán)刮取2～3周的新鮮菌落置于磨菌瓶中，旋渦振蕩10～20 s，將菌液用生理鹽水稀釋至1 mg/ml，再用生理鹽水分別稀釋至10-2mg/ml和10-4mg/ml，然后用22 SWG標準接種環(huán)分別取1滿環(huán)10-2mg/ml和10-4mg/ml的菌液，用劃線法均勻接種至作為對照的中性改良培養(yǎng)基及含藥培養(yǎng)基表面，置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，4周后報告結(jié)果。

四、熒光 PCR 探針熔解曲線法檢測MTB對5種抗結(jié)核藥物的耐藥性

按照熒光PCR探針熔解曲線法耐藥突變檢測試劑盒說明書的要求進行檢測。針對RFP耐藥性基因突變，檢測rpoB基因507～533共27個氨基酸密碼子區(qū)域內(nèi)(81 bp，RFP耐藥決定區(qū))的突變狀況；針對INH耐藥性基因突變，檢測katG315密碼子、inhA94密碼子、inhA啟動子區(qū)(-17～-8位點)和ahpC啟動子(-44～-30及-15～3位點)的突變狀況；針對EMB耐藥性基因突變，檢測embB306、embB406以及embB497共3個密碼子的突變狀況；針對Sm耐藥性基因突變，檢測rpsL43密碼子、rpsL88密碼子、rrs905～908密碼子的突變狀況；針對FQ耐藥性基因突變，檢測gyrA88～94密碼子的突變狀況，從而進行MTB的耐藥篩查。

五、統(tǒng)計學處理

用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以比例法藥敏試驗為標準，計算熒光PCR探針熔解曲線法的敏感度、特異度、一致率和Kappa值(極低一致：0.00～0.20；一般一致：0.21～0.40；中等一致：0.41～0.60；高度一致：0.61～0.80；完全一致：0.81～1.00)。

結(jié) 果

一、比例法藥敏試驗結(jié)果

對153株MTB菌株進行比例法藥敏試驗，其中對RFP耐藥者有45株，敏感者有108株；對INH耐藥者有53株，敏感者有100株；對EMB耐藥者有21株，敏感者有132株；對Sm耐藥者有29株，敏感者有124株；對FQ耐藥者有16株，敏感者有137株。其中，同時對RFP和INH耐藥者有37株，同時對5種抗結(jié)核藥物耐藥者有8株。

二、熒光PCR探針熔解曲線法

熒光PCR探針熔解曲線法檢測153株MTB，檢出49株對RFP耐藥，104株對RFP敏感；52株對INH耐藥，101株對INH敏感；28株對EMB耐藥，125株對EMB敏感；35株對Sm耐藥，118株對Sm敏感；20株對FQ耐藥，133株對FQ敏感。其中，檢測出34株對RFP和INH均耐藥，8株對5種抗結(jié)核藥物均耐藥。

三、敏感度和特異度

以比例法藥敏試驗結(jié)果為標準，熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTB對RFP耐藥性的敏感度為95.56%(43/45)，特異度為94.44%(102/108)，一致率為94.77%(145/153)，Kappa值為0.88；對INH耐藥性的敏感度為90.57%(48/53)，特異度為96.00%(96/100)，一致率為94.12%(144/153)，Kappa值為0.87；對EMB耐藥性的敏感度為85.71%(18/21)，特異度為92.42%(122/132)，一致率為91.50%(140/153)，Kappa值為0.69；對Sm耐藥性的敏感度為89.66%(26/29)，特異度為92.74%(115/124)，一致率為92.16%(141/153)，Kappa值為0.76；對FQ耐藥性的敏感度為93.75%(15/16)，特異度為96.35%(132/137)，一致率為96.08%(147/153)，Kappa值為0.81(表1～5)。

表1 以比例法藥敏試驗為標準熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTB對利福平耐藥性的效能

注敏感度=A/(A+C)×100%；特異度=D/(B+D)×100%；一致率=(A+D)/(A+B+C+D)×100%

表2 以比例法藥敏試驗為標準熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTB對異煙肼耐藥性的效能

注敏感度=A/(A+C)×100%；特異度=D/(B+D)×100%；一致率=(A+D)/(A+B+C+D)×100%

表3 以比例法藥敏試驗為標準熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTB對乙胺丁醇耐藥性的效能

注敏感度=A/(A+C)×100%；特異度=D/(B+D)×100%；一致率=(A+D)/(A+B+C+D)×100%

表4 以比例法藥敏試驗為標準熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTB對鏈霉素耐藥性的效能

注敏感度=A/(A+C)×100%；特異度=D/(B+D)×100%；一致率=(A+D)/(A+B+C+D)×100%

表5 以比例法藥敏試驗為標準熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTB對氟喹諾酮類藥物耐藥性的效能

注敏感度=A/(A+C)×100%；特異度=D/(B+D)×100%；一致率=(A+D)/(A+B+C+D)×100%

討 論

MTB是一種主要侵犯并破壞肺及淋巴系統(tǒng)的慢性生長菌，侵襲肺部后會引起肺結(jié)核，攻擊人的淋巴細胞后將會降低人體免疫力，從而極易引起其他病癥[19]。根據(jù)Trauner等[20]的報道，患者體內(nèi)MTB菌群中存在大量低比例的耐藥突變，這些突變在藥物治療前便已經(jīng)積累，在治療過程中，若沒有采用4種或4種以上有效藥物進行治療，容易導致耐藥菌株的比例不斷上升，最終由敏感菌株變成耐藥菌株，這將使得治療更為艱難。根據(jù)2017年世界衛(wèi)生組織報道，我國是耐藥結(jié)核病高負擔國家之一[21]。臨床上目前使用的耐藥MTB檢測方法主要是經(jīng)過增殖培養(yǎng)后再進行藥敏試驗，需要8周以上的時間，在采樣至報告結(jié)果的這個漫長的等待過程當中，可能會使得結(jié)核病患者不能及時得到有效的治療，導致病情加重，已經(jīng)不能滿足當前的臨床需要。因此，迫切需要一種能快速檢測出MDR-MTB的方法。

近年來，隨著科學技術(shù)的進步，有關(guān)MTB產(chǎn)生耐藥的機制以及其耐藥相關(guān)基因被逐漸揭曉[22-24]?，F(xiàn)有的MTB耐藥分子診斷方法主要有線性探針膜反向雜交法、基因芯片法、基因測序法和熒光PCR探針熔解曲線法等[25-27]。線性探針膜反向雜交法、基因芯片法在6～8 h可獲得結(jié)果，但要求特殊儀器，操作繁瑣，對人員和設施的要求高[15-16]。 基因測序法需要價格昂貴的儀器，且操作繁瑣，不適合臨床推廣。熒光PCR探針熔解曲線法不需要特殊的儀器，在通用的實時熒光定量PCR儀上就能完成整個過程，操作簡便，在3 h內(nèi)就可以得到結(jié)果[28-31]。

本研究結(jié)果顯示，以比例法藥敏試驗為金標準，熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTB對RFP耐藥性基因突變的敏感度為95.56%，特異度為94.44%，一致率為94.77%；馬艷艷等[29]、徐費凡等[14]、嚴虹等[30]研究的敏感度為87.69%～98.51%，特異度為93.90%～95.35%，一致率為92.89%～97.27%。檢測MTB對INH耐藥性基因突變的敏感度為90.57%，特異度為96.00%，一致率為94.12%；徐費凡等[14]、嚴虹等[30]研究的敏感度為80.00%～94.12%，特異度為95.24%～96.40%，一致率為90.70%～94.55%。檢測MTB對EMB耐藥性基因突變的敏感度為85.71%，特異度為92.42%，一致率為91.50%；嚴虹等[30]研究的敏感度為88.64%，特異度為75.76%，一致率為80.91%。檢測MTB對Sm耐藥性基因突變的敏感度為89.66%，特異度為92.74%，一致率為92.16%；嚴虹等[30]研究的敏感度為82.98%，特異度為80.95%，一致率為81.82%。檢測MTB對FQ耐藥性基因突變的敏感度為93.75%，特異度為96.35%，一致率為96.08%；李國利等[31]研究的敏感度為97.01%，特異度為99.55%，一致率為99.21%。5種抗結(jié)核藥物耐藥突變檢測的敏感度、特異度和一致率均與徐費凡等[14]、馬艷艷等[29]、嚴虹等[30]、李國利等[31]研究的結(jié)果接近，但不完全一致，可能的原因是：(1)檢測樣本數(shù)量有所差別，不同的樣本量會導致敏感度、特異度和一致率的波動；(2)雖然本研究采用的藥敏試驗方法與他們研究采用的藥敏試驗方法一致，但是藥敏試驗對操作人員要求高，不同操作人員可能會使得藥敏試驗結(jié)果有所差異。

5種抗結(jié)核藥物的耐藥性基因突變檢測，均出現(xiàn)少數(shù)菌株熒光PCR探針熔解曲線法檢測結(jié)果與藥敏試驗結(jié)果不一致，可分為兩種情況：(1)熒光PCR探針熔解曲線法檢測為野生型，而藥敏試驗結(jié)果為耐藥，出現(xiàn)這種情況的原因可能是本方法所覆蓋耐藥檢測區(qū)以外的DNA序列發(fā)生突變造成耐藥或者其他耐藥機制引起耐藥[28]；(2)熒光PCR探針熔解曲線法檢測為耐藥性基因突變，而藥敏試驗結(jié)果為敏感，原因可能為：一是由于低水平耐藥性基因突變或者同義突變造成菌株耐藥性基因突變后依然對抗結(jié)核藥物敏感[30]；二是由于在藥敏試驗過程中，操作人員操作失誤導致藥敏試驗結(jié)果有偏差。

值得注意的是，在藥敏試驗結(jié)果為對RFP和INH同時耐藥的37株MTB臨床分離株中，熒光PCR探針熔解曲線法檢測出34株耐藥，檢出率為91.89%(34/37)。藥敏試驗結(jié)果為對5種抗結(jié)核藥物同時耐藥的8株臨床MTB分離株中，熒光PCR探針熔解曲線法檢測結(jié)果均為耐藥，說明熒光PCR探針熔解曲線法對多種藥物同時耐藥的MTB檢測效果較佳，在臨床上可以給醫(yī)生重要的耐藥性基因突變信息，輔助醫(yī)生對患者開展聯(lián)合用藥，從而達到最佳的治療效果。

本研究的結(jié)果與比例法藥敏試驗結(jié)果有很強的一致性，說明熒光PCR探針熔解曲線法適用于MTB耐藥性基因突變的快速篩查。同時，本研究也存在一些不足，對于熒光PCR探針熔解曲線法與藥敏試驗不一致的樣本，均采用熔解曲線法進行了重復檢測并獲得一致結(jié)果，但是由于藥敏試驗周期較長，尚未進行重復藥敏試驗，且受條件限制的原因，目前也未進行第三方測序驗證。此外，本研究的檢測對象為培養(yǎng)菌株提取的核酸，對于臨床應用中常見的痰標本檢測尚未進行研究。因此，筆者將在后續(xù)研究中將熒光PCR探針熔解曲線法用于痰標本的MTB耐藥性基因突變的檢測研究中。