彭英 蘇欣 江琦 陳昌明 卞然 鐘聲 高謙 李發(fā)濱

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的嚴重危害人類健康的慢性傳染性疾病。我國是結(jié)核病高負擔國家，根據(jù)《2017年全球結(jié)核病報告》[1]統(tǒng)計，2016年我國結(jié)核病年發(fā)病患者約90萬例，位居全球第3位。結(jié)核分枝桿菌實驗室檢測是結(jié)核病診斷、治療方案制定和治療效果評估的重要依據(jù)。涂片鏡檢、固體培養(yǎng)和傳統(tǒng)藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)仍然是目前常用的細菌學診斷工具。涂片鏡檢方法的敏感度低，固體培養(yǎng)具有較高的敏感度，但是至少需要3～8周的時間，耗時較長，均難以實現(xiàn)對結(jié)核病患者的早期診斷和治療[2]。因此，亟需一種更快速和更可靠的實驗室診斷方法用以輔助臨床診斷，以便早期診斷結(jié)核病。

隨著分子生物學的發(fā)展，近年來涌現(xiàn)出很多方法用于結(jié)核分枝桿菌的快速鑒定，如GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)技術(shù)，因操作方便、報告快速(2 h)、敏感度和特異度較高，被世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦應用于肺結(jié)核及肺外結(jié)核的實驗室診斷[3]；但由于其使用成本較高，在國內(nèi)推廣受到限制。結(jié)核分枝桿菌-交叉引物核酸恒溫擴增技術(shù)(cross-priming amplification，CPA)是一種新型恒溫擴增技術(shù)，除操作簡單、報告快速(2 h)外，價格也合理，比較適宜基層實驗室推廣[4]。為比較與評價上述2種分子檢測技術(shù)在基層實驗室應用的效能，本研究以改良羅氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法(簡稱“固體培養(yǎng)法”)為標準，評價GeneXpert、CPA檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度，探討其應用價值。

資料和方法

一、患者來源及分組

連續(xù)收集黑龍江省五常市結(jié)核病防治所2014年4月至2017年7月初診肺結(jié)核可疑患者作為研究對象，采集其痰標本分別進行固體培養(yǎng)法與快速分子檢測(GeneXpert或CPA)。其中，2014年4月至2017年7月共797例患者(A組)只進行GeneXpert檢測；2016年1月至2017年7月共517例(B組)患者只進行CPA檢測；兩組患者的痰標本均進行了固體培養(yǎng)法檢測。

二、研究方法

1. 痰標本培養(yǎng)：按照分枝桿菌分離培養(yǎng)標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊中的標準化操作程序[5]執(zhí)行。堿處理簡單法操作，加入4%氫氧化鈉溶液進行前處理，然后接種于酸性改良羅氏培養(yǎng)基，在37 ℃ 條件下進行培養(yǎng)。

2. GeneXpert檢測：GeneXpert檢測儀及試劑盒由美國Cepheid公司生產(chǎn)。具體操作按照產(chǎn)品說明書進行：取1 ml前處理標本，加入2倍于標本體積的痰標本處理液，渦旋振蕩器處理15～30 s，靜置15 min；吸取2 ml處理后標本緩慢加入反應盒，然后將反應盒放入儀器進行自動化檢測；反應結(jié)束后，在檢測系統(tǒng)中讀取測試結(jié)果。

3. CPA檢測：使用由杭州優(yōu)思達生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒(注射器法)和結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(恒溫擴增-試紙條法)進行檢測。按產(chǎn)品使用說明書進行操作，用注射器提取菌株DNA加入裝有玻璃化試劑的反應管中，依次加入復溶緩沖液、石蠟油與雙蒸水，混勻后63 ℃水浴1 h，進行恒溫擴增；將擴增完成的反應管放入核酸檢測裝置，15 min內(nèi)判定結(jié)果。檢測區(qū)(T)與質(zhì)控區(qū)(C)均顯現(xiàn)紅色條帶則檢測結(jié)果為陽性，僅C區(qū)出現(xiàn)紅色條帶為陰性。C區(qū)和T區(qū)均無紅色條帶出現(xiàn)，則檢測無效，需重復檢測。

三、統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)錄入Excel 2003軟件，采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學計算與分析。以固體培養(yǎng)法為標準，計算GeneXpert、CPA檢測結(jié)果的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、一致率與Kappa值，Kappa≥0.75認為兩者一致性較好。組間率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、患者痰標本納入與陽性檢出率

A組797例患者的痰標本進行GeneXpert檢測，排除5例“檢測無效”及5例培養(yǎng)污染，最終納入787例。其中，男519例(65.9%)，中位年齡53歲；復治患者占3.2%(25/787)。在787例患者痰標本中，培養(yǎng)陽性229例 (29.1%)，GeneXpert陽性300例(38.1%)。

B組517例患者的痰標本采用CPA檢測，排除6例“檢測無效”與10例培養(yǎng)污染，最終納入501例。其中，男342例(68.3%)，中位年齡54歲；復治患者占5.0%(25/501)。在501例患者痰標本中，培養(yǎng)陽性129例(25.7%)，CPA陽性125例(25.0%)。

二、GeneXpert與固體培養(yǎng)檢測結(jié)果的比較

以固體培養(yǎng)結(jié)果為標準，GeneXpert的敏感度為99.1%(227/229)，特異度為86.9%(485/558)，陽性預測值為75.7%(227/300)，陰性預測值為99.6%(485/487)；一致率為90.5%(712/787)，Kappa值=0.788，說明兩者一致性較好(表1)。

三、CPA與固體培養(yǎng)檢測結(jié)果的比較

以固體培養(yǎng)結(jié)果為標準，CPA的敏感度為81.4%(105/129)，特異度為94.6%(352/372)，陽性預測值為84.0%(105/125)，陰性預測值為93.6%(352/376)；一致率為91.2%(457/501)，Kappa值=0.768，兩者一致性較好(表2)。

四、兩種分子檢測技術(shù)的診斷效能比較

以固體培養(yǎng)為標準，CPA檢測的敏感度(81.4%)低于GeneXpert (99.1%，227/229)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=38.519,P=0.000)；CPA檢測的特異度(94.6%)高于GeneXpert (86.9%，485/558)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=14.727,P=0.001)。CPA、GeneXpert檢測結(jié)果與固體培養(yǎng)的一致率分別為91.2%、90.5%，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.204,P=0.652)。

討 論

為驗證兩種分子生物學快速檢測技術(shù)在縣級實驗室的應用效果，本研究先后對兩組不同時間段內(nèi)的初診疑似肺結(jié)核患者的痰標本分別進行GeneXpert與CPA檢測，同時進行固體培養(yǎng)檢測以評價兩種分子檢測技術(shù)的準確性。

1. GeneXpert檢測技術(shù)的診斷效能分析： 本研究中，GeneXpert檢測的敏感度為99.1%，特異度為86.9%，陽性預測值為75.7%，陰性預測值為99.6%；與固體培養(yǎng)結(jié)果的一致率為90.5%，Kappa值=0.788，說明兩者一致性較好。2010年多個國家對GeneXpert的驗證評估結(jié)果顯示，該方法檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感度與特異度分別為96.0%與98.6%[6]。本研究中，GeneXpert檢測的特異度略低，僅86.9%；但這與國內(nèi)其他研究的檢測結(jié)果一致，如北京市昌平區(qū)應用該方法檢測初診可疑患者的特異度為89.6%[7]。上述差異可能是由于國外研究以檢測敏感度更高的液體培養(yǎng)作為金標準，而國內(nèi)普遍應用固體培養(yǎng)，出現(xiàn)菌量較低時培養(yǎng)陰性的情況；Zhao等[8]報道液體培養(yǎng)較固體培養(yǎng)可多檢出7.5%的陽性患者。因而，可認為GeneXpert更接近液體培養(yǎng)的結(jié)果，較固體培養(yǎng)可檢測出更多的病原學陽性患者。

2.CPA檢測技術(shù)的診斷效能分析：本研究中，CPA檢測技術(shù)的敏感度為81.4%，特異度為94.6%，陽性預測值為84.0%，陰性預測值為93.6%。與固體培養(yǎng)結(jié)果比較，此方法的一致率為91.2%，Kappa值=0.768，說明兩者一致性較好。國內(nèi)Ou等[9]在4個區(qū)(縣)實驗室對CPA的評估顯示，其敏感度為78.1%～89.5%，特異度為95.8%～100.0%，與本研究結(jié)果一致。

表1 A組患者以固體培養(yǎng)檢測結(jié)果為標準判斷GeneXpert檢測技術(shù)的診斷效能

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總檢測例數(shù)×100%；Kappa=(Po-Pc)/(1-Pc)

表2 B組患者以固體培養(yǎng)檢測結(jié)果為標準判斷CPA檢測技術(shù)的診斷效能

注計算公式同表1

3.兩種分子檢測技術(shù)的診斷效能比較：本研究中，CPA檢測的敏感度較GeneXpert低，而特異度高；但是兩種分子檢測方法與固體培養(yǎng)法的檢測結(jié)果一致率進行比較，差異無統(tǒng)計學意義(91.2% vs 90.5%，P=0.652)。河南朱巖昆等[10]、四川邱勇等[11]對患者標本同時進行GeneXpert與CPA檢測，結(jié)果表明，CPA與GeneXpert檢測結(jié)果一致性較高，一致率均達97%以上。

4.兩種分子檢測技術(shù)的局限性與優(yōu)劣勢分析：在結(jié)核分枝桿菌的快速檢測方法中，GeneXpert在基層的應用與推廣受到諸多限制，因而成本較低且一致性高的CPA檢測無疑是一種良好的替代實驗。Trébucq等[12]報道，GeneXpert技術(shù)的設(shè)備價格較高，是妨礙其臨床應用的關(guān)鍵因素。GeneXpert試驗的局限性在于每批次檢測時受儀器模塊的限制，檢測通量常常不能滿足臨床要求；另外，檢測費用高也是限制其推廣的重要原因[13]；同時，GeneXpert試驗要求操作環(huán)境保持一定的溫度與濕度，并且需要持續(xù)不斷的電源供應，在某些情況下還需要采用空調(diào)來調(diào)節(jié)操作和存儲溫度，如此也阻礙了GeneXpert檢測技術(shù)的臨床應用[14-15]。而CPA檢測技術(shù)對實驗室的要求低，試劑可以在常溫下運輸，實驗操作簡單、快速且安全，技術(shù)員經(jīng)過1～2 d的培訓就能夠獨立、熟練地開展工作；且大多數(shù)操作者認為，CPA檢測技術(shù)與傳統(tǒng)的細菌學檢測(涂片和培養(yǎng))相比較，其操作更加容易、便捷，生物安全性更好，室內(nèi)質(zhì)控的可靠性和可操作性更強[16]。

CPA相對GeneXpert的劣勢在于其缺少對結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測。然而，全國結(jié)核病耐藥基線調(diào)查報告表明，涂陽肺結(jié)核患者的臨床結(jié)核分枝桿菌分離株對利福平的耐藥率為9.63%[17]；WHO建議應將GeneXpert檢測應用于耐藥率>20%的高危人群，如持續(xù)涂陽患者、耐多藥患者密切接觸者等，如此診斷患者是否對利福平耐藥將更有意義；而在對利福平耐藥患病率較低的人群中，耐藥性檢測可使用傳統(tǒng)藥敏試驗或其他分子生物學檢測技術(shù)，以增加成本效益[18]。

綜上所述，本研究認為CPA快速診斷方法操作簡單、耗時短、成本低，無需檢測儀器，能夠快速檢測出痰標本中的結(jié)核分枝桿菌，在肺結(jié)核臨床診斷中有較高的敏感度和特異度，并且與固體培養(yǎng)法檢測結(jié)果的一致性較好，有助于早期、快速發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者，相對于GeneXpert檢測，更適于基層實驗室對肺結(jié)核患者進行早期診斷。