相英杰 陳宇桐 王一新

（山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東泰安 271000）

1 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥綜述

1.1 病原學

REV屬反轉(zhuǎn)錄病毒科，γ逆轉(zhuǎn)錄病毒屬，禽C型腫瘤病毒。目前已經(jīng)成功分離30多株REV，雖然不同菌株之間的致病性不同，但它們都具有相對一致的抗原，因此REV只具有一個血清型。除了REV-t菌株外，不同菌株之間有相似的結(jié)構(gòu)和化學特征。根據(jù)單克降體試驗以及中和試驗反應等實驗，可將REV分為Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ三個亞型，其中Ⅰ型具有A，B，C三個抗原表位，Ⅱ型只具有B抗原表位，Ⅲ具有A，B抗原表位。

1.2 流行病學

REV的主要宿主包括火雞，雞，鵝，鵪鶉等，最易感染火雞。REV主要感染日齡較低的雞。其既可以水平傳播，也可以垂直傳播，但主要依靠水平傳播。水平傳播的途徑包括病雞的排泄物和分泌物經(jīng)口感染以及健康及接種受到RVE污染的弱毒疫苗。此外，吸血昆蟲也可傳播疾病。

1.3 致病機理及危害

目前，REV誘發(fā)雞體免疫抑制的分子機制目前尚未完全闡明。REV的P30衣殼蛋白由病毒gag基因所編碼，是RE的群特異性抗原團。REV可引起極強免疫抑制，其靶細胞為淋巴細胞或網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞，嚴重影響機體免疫系統(tǒng)，激活機體體液免疫和細胞免疫，降低機體對其他抗原免疫應答。

2 P30蛋白免疫抑制功能研究實驗

2.1 實驗目的

報道顯示，J亞群禽白血病病毒（Avian leukosis virus-j，ALV-J）與REV同屬反轉(zhuǎn)錄病毒科，ALV-J的P27核衣殼蛋白能夠下調(diào)細胞因子、先天免疫接頭蛋白分子的表達水平，從而抑制宿主的先天免疫。因此推斷REV表層蛋白P30具有相同治病原理。

2.2 主要實驗試劑及器材

標準分子量蛋白 Marker、HRRP標記的抗體；瓊脂粉；脫脂奶粉、甲醇、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜緩沖液；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒；SDS-PAGE Gel Kit；DMEM；鼠抗DTMUV抗體；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

電熱恒溫培養(yǎng)箱；臺式恒溫振蕩器；各量程（最大量程分別為10 μl、50 μl、200 μl及1 000 μl）的微型移液器；臺式高速冷凍離心機；超凈臺；PCR儀；Gdldoc EQ凝膠成像儀；紫外分光光度計；蛋白垂直電泳槽與核酸水平電泳槽；CO2細胞培養(yǎng)箱；酶標儀；熒光定量PCR儀；倒置熒光顯微鏡；化學發(fā)光成像系統(tǒng)。

2.3 實驗步驟簡述

2.3.1 REV p30基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將REV分離株LN1201感染CEF雞胚成纖維細胞被REV分離株LN1201感染，LN1201株p30基因序列通過PCR擴增，連入pcDNA3.1真核表達載體前經(jīng)過雙酶切，構(gòu)建p30基因的真核表達質(zhì)粒pcDNA-p30。

2.3.2 真核表達質(zhì)粒pcDNA-p30的瞬時表達和鑒定

將脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染到CEF。轉(zhuǎn)染72h后，以前期制備成功的小鼠抗REV P30多克隆抗體為一抗，以FITC標記的羊抗鼠IgG為二抗，鑒定pcDNA-p30的表達使用間接免疫熒光試驗（IFA）。同時，取另外一部分轉(zhuǎn)染了pcDNA-p30的CEF，先用RIPA裂解液裂解，再用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜，小鼠抗REV P30多克隆抗體為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，通過western blot試驗鑒定其表達。

2.3.3 過表達p30蛋白對CEF細胞中細胞因子和抗病毒因子表達水平的影響

使用六孔培養(yǎng)板接種CEF細胞，培養(yǎng)過夜。后用脂質(zhì)體2000，將真核表達質(zhì)粒pcDNA-p30轉(zhuǎn)染CEF細胞，與此同時轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒pcDNA3.0作為對照。轉(zhuǎn)染48h后，加入20μl 濃度為1μg/ml的 LPS或者20μl濃度為5μg/ml的 poly（I：C）刺激細胞，在刺激后的第1、6、12、24和48h不同時間點分別收集細胞，通過real-time PCR檢測pcDNA-p30轉(zhuǎn)染CEF和空載體pcDNA3.0轉(zhuǎn)染CEF中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IFN-α、IFN-β、TNF-α和TNF-α等細胞因子，以及MYD88、TAK1、IRAK-4、NF-κB、TRAF-6、IRF-7和TRIF等相關(guān)抗病毒因子的表達情況。最后，使用ELISA試劑盒，檢測細胞上清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IFN-α、IFN-β、TNF-α和TNF-α等細胞因子的含量，分析REV P30蛋白對CEF先天免疫功能的抑制作用。

2.4 實驗結(jié)果

（1）RVE其衣殼蛋白P30免疫抑制功能原理與AVI-J的衣殼蛋白P27免疫抑制原理相似。

（2）REV的衣殼蛋白P30能夠下調(diào)細胞因子、先天免疫接頭蛋白分子的表達水平，從而抑制宿主的先天免疫。

2.5 實驗意義

REV具有較強的免疫抑制特性，目前對其誘發(fā)免疫抑制的分子機制尚未完全闡明。特別是對于REV抑制家禽先天免疫的作用及其分子機制目前還沒有研究報道。鑒于衣殼蛋白在其他反轉(zhuǎn)錄病毒中具有免疫抑制功能，明確REV P30蛋白的免疫抑制功能對于有效防控REV，全面理解家禽先天免疫功能提供科學資料。