任小山 綜述 楊 立 審校

Klotho基因、蛋白及功能簡介

Klotho基因是1997年由日本學(xué)者Kuro-o等[1]在研究自發(fā)型高血壓小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn),以希臘神話中掌控人類生命線的女神Klotho命名，該基因定位于人類第13號染色體上,含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子,全長50 kb。Klotho基因的缺陷加快實(shí)驗(yàn)小鼠衰老,早期出現(xiàn)性功能減退、皮膚萎縮、骨質(zhì)疏松等。

Klotho基因編碼的Klotho蛋白主要存在于循環(huán)和尿液[2]。該蛋白有膜結(jié)合型和分泌型(即αKlotho)兩種形式。前者由胞外區(qū)域 (約980個(gè)氨基酸殘基的氨基末端)、跨膜區(qū)域和胞內(nèi)區(qū)域 (11個(gè)氨基酸殘基的羧基端) 構(gòu)成,其中胞外區(qū)域含有2個(gè)重復(fù)的440個(gè)氨基酸殘基序列,命名為KL1和KL2。2個(gè)重 復(fù) 序 列 的 連 接 區(qū) 域 為Lys-Lys-Arg-Lys保守序列,是蛋白酶裂解的潛在位點(diǎn)[3](圖1)。而分泌型Klotho被選擇性剪切釋放到胞外,其具有糖苷酶活性，抑制氧化應(yīng)激,又稱為可溶性Klotho[4]。可溶性Klotho在腎臟高表達(dá)且優(yōu)先表達(dá)于腎臟，主要在遠(yuǎn)曲小管分泌產(chǎn)生，有多種的生物學(xué)效應(yīng)，包括細(xì)胞保護(hù)、抗氧化及抗纖維化[5]。

圖1 Klotho蛋白基本結(jié)構(gòu)[6]膜型Klotho蛋白為單向跨膜分子，其基本結(jié)構(gòu)由細(xì)胞外功能區(qū)域、跨膜區(qū)域、胞內(nèi)區(qū)域、連接區(qū)域、單序列區(qū)組成；分泌型 Klotho 蛋白來源：大部分由解聚素-金屬蛋白酶水解膜型Klotho蛋白形成，小部分由 Klotho 基因選擇性表達(dá)合成

Klotho蛋白與腎缺血再灌注損傷(RIRI)

RIRI指在腎臟缺血的基礎(chǔ)上再次恢復(fù)血流，組織損傷反而加重的病理現(xiàn)象，其引起的急性腎損傷(AKI)在臨床的死亡率很高。發(fā)生機(jī)制復(fù)雜且尚不明確，目前認(rèn)為與缺血再灌注后的炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、細(xì)胞凋亡等有關(guān)。上述損傷機(jī)制并非孤立存在,其間存在顯著交互作用,共同作用于上游載體“內(nèi)皮細(xì)胞”[7]。內(nèi)皮細(xì)胞是組織缺血再灌注損傷(IRI)發(fā)生的前沿細(xì)胞,其自身分泌的多種細(xì)胞因子亦參與RIRI過程[8]。內(nèi)皮功能損傷及微循環(huán)紊亂是IRI的重要標(biāo)志和發(fā)生基礎(chǔ)[9]。

一項(xiàng)研究通過利用H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型,發(fā)現(xiàn)Klotho蛋白顯著提高H2O2氧化損傷后HUVEC存活率,首次證明Klotho蛋白能夠減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其可能機(jī)制是Klotho蛋白維持HUVEC細(xì)胞完整性并有助于HUVEC抗氧化能力的恢復(fù)和抑制HUVEC產(chǎn)生活性氧(ROS)[10]。前人相關(guān)研究亦表明 Klotho 蛋白可以緩解HUVEC的凋亡和衰老[11]。Maekawa等[12]已經(jīng)證實(shí)Klotho可能通過絲裂原活化激酶途徑保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免于凋亡。有學(xué)者通過腺病毒載體將Klotho轉(zhuǎn)染至小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)其明顯改善內(nèi)皮細(xì)胞功能[13]。在腎臟中，Klotho亦可通過激活自噬減輕缺血性損傷，減輕腎纖維化，并阻止AKI進(jìn)展為慢性腎臟病(CKD)[14-15]。 Castellano等[16]通過對尸體捐獻(xiàn)者腎臟中的分析表明，Klotho在植入前腎組織檢查中顯著表達(dá)，然而，與早期移植功能恢復(fù)患者相比，移植物功能延遲恢復(fù)的患者Klotho下調(diào)[16]。 Cho等[17]在AKI和CKD的早期階段觀察到血清和尿Klotho水平降低，而晚期階段逐漸下降。既往有學(xué)者用攜帶Klotho基因的腺病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Klotho腺病毒的BMSCs更好地緩解RIRI[18]。

圖2 Klotho蛋白與RIRI相關(guān)機(jī)制[6]RIRI：腎缺血再灌注損傷；IL：白細(xì)胞介素；NF-κB:核因子κB;ROS:活性氧；RIRI致細(xì)胞內(nèi)皮損傷，誘發(fā)炎癥、鈣超載、過氧化、線粒體功能障礙及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促成一系列胞內(nèi)胞外反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，Klotho 蛋白可抑制炎癥反應(yīng)、鈣超載、過氧化，減少細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)腎臟結(jié)構(gòu)及功能

Klotho蛋白與炎癥炎癥反應(yīng)是缺血再灌注的關(guān)鍵，是一切損傷的開始。組織缺血再灌注可引起中性粒細(xì)胞激活并釋放炎癥細(xì)胞因子,細(xì)胞因子介導(dǎo)組織損傷、壞死,從而活化炎癥細(xì)胞釋放更多炎癥細(xì)胞因子。已經(jīng)有研究表明，Klotho基因編碼的Klotho蛋白具有抑制炎癥反應(yīng)等作用，其機(jī)制可能與Klotho增加心肌HSP70水平，抑制核因子κB(NF-κB)活化(圖2)，減少老年內(nèi)毒素血癥小鼠的細(xì)胞因子水平和改善的心臟功能有關(guān)[19]。同時(shí)，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，炎性細(xì)胞因子TWEAK和TNF通過NF-κB信號通路減少腎臟中Klotho基因表達(dá)[20]。Hu等[21]學(xué)者研究證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)Klotho可能參與ATP依賴性RNA解旋酶DDX58(也稱為視黃酸誘導(dǎo)基因1蛋白)介導(dǎo)的炎癥抑制途徑發(fā)揮效應(yīng)。

Klotho蛋白與細(xì)胞內(nèi)鈣超載鈣離子存在于胞內(nèi)飾各種角色，可作為第二信使、代謝調(diào)節(jié)因子、膜穩(wěn)定劑參與細(xì)胞膜生物電和胞內(nèi)生化、亦參與修復(fù)基因轉(zhuǎn)錄核蛋白磷酸化和細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞正常機(jī)能活動(dòng)中起重要作用，RIRI后,胞外鈣離子大量內(nèi)流引發(fā)鈣超載，因過氧化產(chǎn)物持續(xù)損傷組織和含巰基的蛋白質(zhì)和酶,進(jìn)一步加重鈣超載。胞內(nèi)鈣超載則激活鈣敏蛋白水解酶、磷脂酶等,使胞膜水解、破壞線粒體正常結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致ATP產(chǎn)量減少、干擾體內(nèi)細(xì)胞中鈣穩(wěn)態(tài)?？赡茉蚴蔷S生素D代謝改變，但存在其他可能性，在腎臟，Klotho增強(qiáng)型小鼠表現(xiàn)出瞬時(shí)感受電位V5(TRPV5)的表達(dá)增加和鈉/鈣交換劑的表達(dá)降低，進(jìn)而有利于維持體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)[22](圖2)。有報(bào)道提出Klotho可作為輔助因子(體內(nèi)形成FGF-23 -Klotho軸)調(diào)節(jié)腎臟鈣、磷和維生素D代謝[23-24]。但可溶性Klotho作為一種內(nèi)分泌因子，具有多種腎臟和腎外效應(yīng)，亦可獨(dú)立于FGF-23起作用[25]。Hu等[26]研究表明Klotho通過與腎臟，骨骼，腸道和甲狀旁腺中的其他“鈣磷酸化調(diào)節(jié)”激素[如PTH，F(xiàn)GF-23和1,25(OH)2D3]相互作用參與礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié),從而保護(hù)腎臟結(jié)構(gòu)和功能。

Klotho蛋白與氧化應(yīng)激氧化應(yīng)激是指機(jī)體ROS產(chǎn)生過多和(或)抗氧化能力下降，使得ROS大量蓄積而引起的損傷。是目前公認(rèn)導(dǎo)致缺血再灌損傷的重要機(jī)制,ROS、氧自由基等破壞細(xì)胞膜、細(xì)胞核,激發(fā)或加重?fù)p傷。有文獻(xiàn)提及，Klotho可緩解RIRI,可能通過誘導(dǎo)錳超氧化物歧化酶(MnSOD)表達(dá)，即Klotho通過增加一種上調(diào)MnSOD的轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白O亞家族3a(FOXO3a) 的磷酸化發(fā)揮作用[27]。 Qian等[28]提到Klotho保護(hù)來自IRI的管狀上皮細(xì)胞及其抗壞死作用可能與氧化應(yīng)激抑制有關(guān)(圖2)。Drew等[29]研究表明盡管已知低溶解性Klotho水平與氧化應(yīng)激之間的關(guān)聯(lián)，但關(guān)于可溶性Klotho水平與腎功能變化之間的縱向關(guān)聯(lián)的信息仍很少。

Klotho蛋白與細(xì)胞凋亡RIRI發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜,其中腎小管上皮細(xì)胞凋亡在RIRI誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用,是導(dǎo)致腎功能衰竭的重要原因之一[30]。Alexander等[22]研究證實(shí)，Klotho通過促進(jìn)熱休克蛋白70(HSP-70)表達(dá)減少實(shí)驗(yàn)性急性缺血性腎臟的細(xì)胞凋亡且增加對氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的抵抗力。在心肌細(xì)胞中，Klotho通過下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制小鼠心肌細(xì)胞凋亡引起的心臟損傷[31](圖2)。 Qian等[28]發(fā)現(xiàn)，Klotho可通過靶向抑制腎缺血再灌注氧化反應(yīng)，從而減少腎臟上皮細(xì)胞壞死性凋亡。

前景與展望

近年來，腎移植術(shù)后RIRI已成為影響受者預(yù)后及術(shù)后長期免疫抑制劑療效的關(guān)鍵因素。Klotho基因編碼的Klotho蛋白高表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，且具有對抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷離子代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等多種生理功能，通過上調(diào)Klotho基因來增加其編碼的蛋白在腎臟上皮細(xì)胞中產(chǎn)量，從而保護(hù)或延緩腎移植術(shù)后IRI，同時(shí)對于急性或慢性腎病患者，補(bǔ)充外源性Klotho和(或)調(diào)節(jié)內(nèi)源性Klotho生成可能是一種可行的治療策略，有望為今后腎移植工作及急慢性腎臟病的治療提供新思路。