吳美芹，孟令凱

（招遠(yuǎn)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東招遠(yuǎn) 265400）

熱應(yīng)激除了降低采食量外，還可直接危害豬的健康狀況，其中熱應(yīng)激引起的兩種主要疾病是氧化應(yīng)激和呼吸性堿中毒，這兩種疾病均對豬的健康造成全面危害（李靜等，2005）。在熱應(yīng)激條件下，豬將血液重新分配到周圍組織，并增加呼吸頻率，以最大限度地散熱。因此，隨著體溫的升高，內(nèi)臟組織血流量減少，引發(fā)豬腸道和骨骼肌氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是自由基和抗氧化能力失衡的結(jié)果，它破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核苷酸，從而擴(kuò)大對細(xì)胞和器官的功能的影響，特別是氧化蛋白的增加與家畜各種代謝紊亂有關(guān)（黃帆和呂秋鳳，2017）。另一方面，過度呼吸會降低血液中的二氧化碳含量，從而引發(fā)堿中毒，呼吸性堿中毒可干擾機(jī)體各種生化和生理過程，如降低鈣離子濃度，增加乳酸生成（趙久成和公海濤，2016）。因此，減輕豬氧化應(yīng)激和呼吸性堿中毒對維持豬的健康和生產(chǎn)至關(guān)重要，營養(yǎng)劑補(bǔ)充可能為緩解豬氧化應(yīng)激和呼吸性堿中毒提供一種靈活、經(jīng)濟(jì)的策略。

維生素E是一種脂溶性抗氧化劑，能中和自由基，NRC（2012）建議正常飼養(yǎng)條件下的豬日糧中維生素E含量應(yīng)達(dá)到11 IU/kg。但目前還不清楚豬是否需要更多維生素E來對抗氧化應(yīng)激。Chauhan等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，日糧超劑量補(bǔ)充抗氧化物質(zhì)（100 IU/kg 維生素E+1.2 mg/kg硒）不僅可以減輕氧化應(yīng)激，還有效改善熱應(yīng)激條件下羊的呼吸頻率和呼吸性堿中毒，表明短期超量補(bǔ)充抗氧化劑可以有效維持機(jī)體酸堿平衡，減輕熱應(yīng)激介導(dǎo)的氧化應(yīng)激。因此，本研究旨在探討日糧短期超劑量添加維生素E對熱應(yīng)激條件下豬氧化還原狀態(tài)的影響，確定維生素E在改善呼吸性堿中毒中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與日糧設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用2×2因子設(shè)計(jì)，包括兩種日糧處理和兩種溫度條件。將48頭平均體重為（24±2）kg的生長豬隨機(jī)分為2組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)6頭豬。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧（維生素E水平為17.5 IU/kg），處理組在基礎(chǔ)日糧中額外補(bǔ)充維生素E，使維生素E水平達(dá)到205 IU/kg。豬只飼喂14 d后，將對照組和處理豬分別置于溫度為20℃、相對濕度45%的條件和溫度為35.5℃、相對濕度為35%～45%的條件下飼養(yǎng)7 d。對照組日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)期間，豬只被單獨(dú)飼養(yǎng)在帶有金屬網(wǎng)地板的板條箱中。為盡量減少兩個不同溫度組采食量的差異，將采食量限制在20℃條件下豬只自由采食量的75%左右。

表1 日糧原料組成及營養(yǎng)水平

1.2 生理狀況監(jiān)測 在7 d熱應(yīng)激期間，每天分別于9點(diǎn)、13點(diǎn)和16點(diǎn)監(jiān)測豬的呼吸頻率和測定直腸溫度3次。直腸溫度用電子體溫計(jì)測量，用秒表在20 s內(nèi)測定呼吸頻率。

1.3 血液采集及氣體分壓測定 分別在熱應(yīng)激第7天的9點(diǎn)和15點(diǎn)從頸靜脈采集血樣2次，血液樣品用于測量二氧化碳分壓、氧氣分壓、碳酸氫鹽濃度和pH。血液樣本分裝在肝素鈉和EDTA包被的采血管中，采集0.5 mL白細(xì)胞，加入1 ml RNAlater溶液，4℃保存過夜后于-20℃保存。肝素化的血漿樣本保存在-80℃，直到進(jìn)一步分析氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物。

1.4 基因表達(dá)分析 試驗(yàn)分析了熱休克蛋白70基因（HSP70）和缺氧誘導(dǎo)因子1α基因（HIF-1α）的表達(dá)豐度。引物設(shè)計(jì)和PCR操作參考Liu等（2018）的方法。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS通用線性模型，以重復(fù)為試驗(yàn)單元。直腸溫度和呼吸頻率試驗(yàn)數(shù)據(jù)以溫度×日糧×?xí)r間的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。血液變量的結(jié)果匯總并以溫度×日糧的均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，P＜0.05為差異顯著，P＜0.10為有顯著差異趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 采食量和生理狀況 試驗(yàn)期間通過限制日采食量保證對照組與處理組平均日采食量為（1.46±0.002）kg，平均日采食量不受溫度和日糧處理影響（P＞0.05，數(shù)據(jù)未列出）。由圖1可知，熱應(yīng)激使直腸溫度顯著升高（20℃和35℃組分別為38.3℃和39.6℃，P＜0.05）。溫度和時間對直腸溫度的影響具有顯著交互作用（P＜0.05），直腸溫度從9點(diǎn)的38.6℃升高到13點(diǎn)的39.9℃，之后在16點(diǎn)維持在40.1℃。日糧處理對直腸溫度無顯著影響（P＞0.05），同時日糧、溫度和時間對直腸溫度的影響無顯著交互作用（P＞0.05）。

圖1 日糧和溫度對生長豬直腸溫度的影響

由圖2可知，熱應(yīng)激顯著提高了生長豬呼吸頻率（20℃和35℃為31～124次/min，P＜0.05），溫度與時間之間存在顯著交互作用（P＜0.05），在9～13點(diǎn)呼吸速率由51次/min增加到154次/min，在16點(diǎn)趨于平穩(wěn)為166次/min，而在20℃時，全天的呼吸頻率維持不變（P＞0.05）。日糧處理對呼吸頻率無顯著影響（P＞0.05），同時日糧、溫度和時間對呼吸頻率的影響無顯著的交互作用（P＞0.05）。

圖2 日糧和溫度對生長豬呼吸頻率的影響

2.2 血液氣體變量 由表2可知，血中二氧化碳分壓由58.7 mmHg顯著下降至46.8 mmHg（P＜0.05），碳酸氫鹽由37.0下降至33.1 mmHg（P＜ 0.05），pH由 7.42上 升 至 7.46（P ＜ 0.05）。溫度對血氧氣分壓無顯著影響（P＜0.05）。日糧維生素E水平對二氧化碳、氧氣分壓、pH和碳酸氫鹽無顯著影響（P＞0.05），但溫度和日糧對血液氣體分壓、碳酸氫鹽和pH的影響具有顯著交互作用（P＜0.05）。在20℃條件下，對照組與處理組對血液氣體分壓、碳酸氫鹽和pH的影響無顯著差異（P＞0.05），但在35℃條件下，與對照組相比，處理組二氧化碳分壓、碳酸氫鹽含量顯著提高（P＜0.05），血液pH顯著降低（P＜0.05）。

2.3 血液氧化應(yīng)激指標(biāo)和相關(guān)基因表達(dá) 由圖3和圖4可知，熱應(yīng)激顯著增加HSP70基因mRNA豐度（P＜0.05），有提高HIF-1α基因mRNA豐度的趨勢（P=0.08）。

圖3 日糧和溫度對生長豬HSP70基因mRNA豐度的影響

圖4 日糧和溫度對生長豬HIF-1α基因mRNA豐度的影響

由表3可知，溫度和日糧處理對活性氧濃度均無顯著影響（P＞0.05），但溫度和日糧對血漿活性氧濃度的影響具有顯著交互作用（P＜0.05）。熱應(yīng)激使血漿生物抗氧化物含量2.97 mM顯著降低至2.74 mM（P＜0.05），但日糧處理對該指標(biāo)無顯著影響（P＞0.05）。熱應(yīng)激有提高氧化蛋白產(chǎn)物的趨勢（P=0.07），從16.4 μM升高至26.9 μM，但日糧處理對該指標(biāo)無顯著影響（P＞0.05）。溫度和日糧處理對血漿硫醇基水平均無顯著影響（P＞0.05）。

表2 日糧和溫度對生長豬血液氣體變量的影響

表3 日糧和溫度對生長豬血液氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

3 討論

本研究的假設(shè)是短期過量補(bǔ)充維生素E（200 IU/kg）可以減輕熱應(yīng)激對豬的生理反應(yīng)、呼吸性堿中毒和氧化應(yīng)激的影響。研究數(shù)據(jù)表明，本研究使用的維生素E補(bǔ)充劑并沒有減輕豬的氧化應(yīng)激，但緩解了熱應(yīng)激誘導(dǎo)的呼吸性堿中毒。熱應(yīng)激使直腸溫度升高了1.3℃，呼吸速率提高3倍，有利于豬散熱。同時，熱應(yīng)激使豬呼吸率增加，導(dǎo)致血二氧化碳分壓下降20%，從而降低碳酸氫鹽濃度。盡管如此，正常的血液pH卻無法維持，因?yàn)檠簆H從7.42增加到7.46，整個過程為典型的呼吸性堿中毒，不能用代謝性酸中毒來補(bǔ)償。Chauhan等（2015）發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激期間日糧補(bǔ)充抗氧化劑可以使血血液二氧化碳分壓降低50%，阻止血液pH升高，避免血碳酸氫鹽濃度降低，這與本研究結(jié)果一致。雖然目前還不清楚高劑量維生素E改善血液中二氧化碳分壓損失的機(jī)制，但其效果與改善熱應(yīng)激綿羊呼吸頻率無關(guān)，因?yàn)楸狙芯恐懈邉┝烤S生素E組并沒有降低熱應(yīng)激豬的呼吸頻率。換句話說，日糧補(bǔ)充維生素E可能對維持血液中二氧化碳濃度有直接作用，從而緩解熱應(yīng)激引起的呼吸性堿中毒。

血漿中氧化蛋白產(chǎn)物水平的提高可以說明熱應(yīng)激引起氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激的增加可能是由于抗氧化防御系統(tǒng)受損，因?yàn)樵跓釕?yīng)激期間生物抗氧化物降低9%。氧化應(yīng)激的增加與熱應(yīng)激豬體溫升高有關(guān)，可以通過白細(xì)胞中HSP70 基因mRNA豐度增加證明。但與熱應(yīng)激水平相似的綿羊不同（Chauhan等，2014），本研究結(jié)果的血漿活性氧濃度不受熱應(yīng)激條件的影響，這表明生物抗氧化物的降低不是由自由基增加引起的，但還應(yīng)考慮影響抗氧化穩(wěn)定性的其他因素。飼糧中添加維生素E并不能減輕熱應(yīng)激組豬的氧化應(yīng)激，因?yàn)闊o論是生物抗氧化物的降低還是氧化蛋白產(chǎn)物的增加都不能通過添加維生素E得到緩解。本研究補(bǔ)充維生素E的總時間為3周，包括前2周和熱應(yīng)激1周。Kim等（2015）認(rèn)為，連續(xù)3周補(bǔ)充維生素E足以增強(qiáng)組織維生素E的儲備，補(bǔ)充維生素E（300 IU/kg）2周后，豬血漿和肌肉維生素E濃度達(dá)到最大濃度的80%。

本試驗(yàn)在20℃條件下，補(bǔ)充維生素E的日糧使豬血液中活性氧濃度降低20%，這表明日糧高劑量維生素E在中和正常生理狀態(tài)下的自由基方面優(yōu)于NRC（2012）推薦水平。但在熱應(yīng)激條件后，高劑量維生素E組和對照組血漿中活性氧濃度的差異減小，但具體機(jī)制尚不清楚。我們推測，維生素E、維生素C、谷胱甘肽等抗氧化劑缺乏協(xié)同作用，可能限制了維生素E對熱應(yīng)激豬氧化應(yīng)激的緩解作用，因?yàn)榫S生素E的重建需要維生素C和谷胱甘肽過氧化物酶的參與（Rooke等，2004）。同樣，在高溫條件下添加125 mg/kg維生素E和0.5 mg/kg硒的肉雞比單獨(dú)添加維生素E或硒的肉雞血漿丙二醛濃度降低（Ghazi等，2012）。因此作者認(rèn)為，下一步應(yīng)該研究日糧抗氧化物質(zhì)的組合對熱應(yīng)激介導(dǎo)的氧化應(yīng)激的改善作用。

4 結(jié)論

綜上所述，在7 d反復(fù)熱應(yīng)激條件下，日糧連續(xù)3周補(bǔ)充200 IU/kg的維生素E并不能緩解生長豬的氧化應(yīng)激。但日糧補(bǔ)充維生素E可以預(yù)防熱應(yīng)激條件下生長豬發(fā)生呼吸性堿中毒。