張 璐，朱曉鵬，長孫東亭，羅素蘭

(海南大學 海洋學院/熱帶生物資源教育部重點實驗室/?？谑泻Ｑ笏幬镏攸c實驗室，?？?570228)

煙堿型乙酰膽堿受體(Nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)是一種由五聚體亞基組成的配體門控離子通道，可分為神經(jīng)型nAChRs和肌肉型nAChRs。目前，研究較多的神經(jīng)型nAChRs的亞型有：α3β2，α3β4，α4β2，α6/α3β2β3，α7，α9α10等；肌肉型nAChRs有α1β1δγ和α1β1δε2類[1]。神經(jīng)型nAChRs與一系列神經(jīng)生理和病理過程密切相關[2]。β亞基作為一種重要的輔助型亞基，與α亞基結合，形成五聚體結構，協(xié)同作用發(fā)揮配體門控離子通道的功能。包含β亞基的nAChR廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中，目前，已發(fā)現(xiàn)多種疾病與β亞基的功能相關，如：疼痛，帕金森氏癥，抑郁癥，阿爾茨海默癥，藥物成癮及腦損傷修復等[3-8]。β亞基上氨基酸的變化會造成nAChRs功能的變化，從而導致疾病的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，夜間額葉癲癇癥就是因為nAChR上的β2亞基第287位的纈氨酸發(fā)生了突變，影響了離子通道的活性，導致出現(xiàn)癲癇癥狀[9]。 定點突變技術是目前研究目的蛋白中關鍵氨基酸的一種常用技術，利用定點突變技術能定向對關鍵氨基酸進行突變，研究目的蛋白中關鍵氨基酸的作用，以及發(fā)現(xiàn)配體與受體相互作用的關鍵位點。如： ZHANGSUN D等[10]選擇5個鼠源(rat)β2亞基上的氨基酸位點設計了點突變體，并選擇α-芋螺毒素LvIA(α-Conotoxin LvIA，簡稱α-CTx LvIA)為探針，檢測突變型nAChR藥理學特性的變化，研究發(fā)現(xiàn)，胞外N端第59和119位2個重要氨基酸位點突變后，受體對α-CTx LvIA的結合活性增強。CUNY H等[11]也利用了定點突變的方式探究α-CTxs與nAChRs結合的關鍵氨基酸位點，結果發(fā)現(xiàn)，β2亞基上胞外N端第59和113位氨基酸改變后，受體對α-CTxs的敏感性會發(fā)生改變。α3β4 nAChR亞型是治療尼古丁依賴、藥物濫用、小細胞肺癌、過度飲食和肥胖的潛在靶點[12-14]。β4亞基上的關鍵氨基酸對β4的病理、藥理活性具有重要作用，也是許多配體藥物作用的重要靶點。研究β4亞基上的關鍵位點信息，對于配體藥物及先導化合物的研究具有重要意義。有研究表明，β4亞基上Loop F區(qū)域的氨基酸位點可以影響受體與激動劑和拮抗劑的結合[11]。Loop F中第168位的異亮氨酸(Ile)是β4亞基與β2亞基的區(qū)分性位點，體現(xiàn)出β4亞基的藥理學特性。筆者利用PCR介導的定點突變技術，選擇β4亞基上胞外N端配體結合域Loop F中第168位的異亮氨酸(Ile)進行定點突變，構建包含β4亞基的煙堿型乙酰膽堿受體點突變體模型，并利用雙電極電壓鉗技術對激動劑ACh和拮抗劑α-CTx RegIIA對突變受體的活性進行檢測，旨在為研究β4亞基中關鍵氨基酸的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細胞由本實驗室保存；含有α3，β4 nAChRs亞基基因的質粒獲贈于美國猶他大學。乙酰膽堿(ACh)、膠原酶A購自美國Sigma-Aldrich公司；質粒提取試劑盒(OMEGA)，PCR突變試劑盒(Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit)，cRNA體外轉錄試劑盒mMESSAGE mMACHINE Kit，RNA產(chǎn)物回收試劑盒MEGA clear Kit等購自美國ThermoFisher Scientific公司；質粒線性化所需的多種限制性內切酶等購自寶生物(大連)有限公司；ND96生理緩沖液：96 mmol·L-1NaCl，2 mmol·L-1KCl，1.8 mmol·L-1CaCl2，1 mmol·L-1MgCl2，5 mmol·L-1HEPES，pH7.3～7.7；突變引物的合成和突變體的測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。實驗用雌性非洲爪蟾(Xenopuslaevis)由美國進口(Nasco)。

1.2 突變體引物的設計針對鼠源β2和β4 2種亞基在胞外N端配體結合區(qū)的氨基酸序列進行對比，選擇亞型特異性的差異氨基酸位點作為突變對象。本實驗中選擇的是鼠源β4亞基胞外N端氨基酸序列第168位的異亮氨酸(Ile)，將該位點突變成鼠源β2亞基對應位置的絲氨酸(Ser)，可作為研究2種亞型特異性的1種模型。利用Primer Premier 5.0軟件設計突變位點的上下游引物(表1)。

表1 突變位點上下游引物序列

1.3 PCR介導的定點突變以包含鼠源β4亞基序列的質粒為模板，采用PCR介導的定點突變技術對β4亞基上第168位氨基酸進行定點突變。包含突變位點的1對引物和模板質粒退火后用高保真聚合酶進行擴增。PCR反應條件為：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火10 s，延伸階段68 ℃ 3 min，末次循環(huán)階段68 ℃ 2 min，共25個循環(huán)。正反向引物的延伸產(chǎn)物退火后配對成為不完整的開環(huán)質粒。PCR擴增得到的產(chǎn)物用w=0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，電壓為90 V，經(jīng)過15 min，觀察電泳結果。在PCR產(chǎn)物中加1 μL Dpn Ⅰ酶、37 ℃水浴消化質粒模板，Dpn Ⅰ酶除去模板質粒。開環(huán)質粒轉入DH5α感受態(tài)細胞后，選取單克隆，培養(yǎng)后提取質粒。通過測序確定目標位點是否突變正確。

1.4 突變體RNA的制備大量提取突變正確的突變體質粒，使用限制性內切酶Xho Ⅰ進行酶切，獲得線性化模板。酶切產(chǎn)物純化后，使用w=0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，保留純度和濃度符合要求的線性化DNA作為體外轉錄的模板，利用T3體外轉錄試劑盒進行體外轉錄。20 μL反應體系：1～1.5 μg 模板，

2 μL 10×Reaction Buffer，10 μL 2×dNTP，1 μL逆轉錄酶，37 ℃，體外轉錄4 h，獲得對應基因的cRNA。此外，為了消除質粒模板的影響，使用DNAse酶處理轉錄產(chǎn)物。cRNA經(jīng)RNA純化試劑盒純化后，利用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳，檢測cRNA的濃度和純度，確定是否符合顯微注射的要求。

1.5 非洲爪蟾卵母細胞獲取和顯微注射麻醉非洲爪蟾1 h后，取出成團卵母細胞，膠原酶酶解后，分離獲得單個卵母細胞(圖1)。β4亞基突變體cRNA和β4亞基本體cRNA分別與α3亞基cRNA(1∶1)混合，顯微注射到爪蟾卵母細胞，注射RNA體積為每個卵母細胞注入59.8 nL RNA。經(jīng)注射cRNA的卵母細胞在含抗生素的ND96生理緩沖液中，17 ℃培養(yǎng)2 d后進行電生理活性檢測。

1.6α3β4nAChR及其突變體的藥理活性檢測非洲爪蟾卵母細胞注射cRNA 2 d后，置于50 μL細胞槽中，室溫下，利用雙電極電壓鉗進行檢測。卵母細胞的鉗制電位為-70 mV。用作重力灌注的ND96緩沖液流速為2 mL·min-1。卵母細胞每分鐘給予1 s 100 μmol·L-1ACh刺激，以引起內向電流產(chǎn)生?；€穩(wěn)定后，停止灌流，在細胞槽中加入5 μL ND96生理緩沖液或5 μL不同濃度的α-CTx RegIIA溶液(從低濃度到高濃度：10-9，10-8，10-7，10-6，10-5mol·L-1)，靜置5 min后，開啟記錄模式，記錄不同孵育條件下受體電流的變化。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計ND96溶液孵育非洲爪蟾卵母細胞5 min后，以100 μmol·L-1ACh刺激1 s引發(fā)的電流作為基礎電流(記錄3次，取平均值作為標準電流值)。不同濃度α-CTx RegIIA孵育卵母細胞5 min后，記錄100 μmol·L-1ACh誘發(fā)的電流值作為反應電流值(反應率=反應電流值/標準電流值)。根據(jù)不同濃度α-CTx RegIIA引發(fā)的電流反應值，計算它對受體的半數(shù)阻斷劑量(IC50)。劑量反應曲線符合非線性擬合方程：

反應率=100 /(1+([toxin] / IC50)nH)，

式中，nH是Hill系數(shù)，[toxin]代表α-CTx RegIIA的濃度，IC50是半阻斷濃度。

利用GraphPad Prism(GraphPad Software，San Diego，CA)軟件進行分析和作圖。每個數(shù)據(jù)點至少包含3個以上卵母細胞的統(tǒng)計值。

2 結果與分析

2.1 突變體PCR產(chǎn)物電泳圖從圖2可知，孔道1(加入的是突變體PCR產(chǎn)物)擴增條帶在5 000 bp附近，符合目的條帶長度，且條帶清晰明亮，可用于下一步轉化實驗。

2.2 突變體質粒測序突變體質粒的測序結果和NCBI比對結果如圖3所示。β4亞基N端配體結合區(qū)第168位密碼子ATC(Ile)突變?yōu)槊艽a子AGT(Ser)，定點突變準確無誤。

2.3 cRNA制備從圖4可知，孔道1(突變體質粒)的條帶在3 000 bp附近，孔道2(質粒酶切后產(chǎn)物)的條帶在5 000 bp附近，孔道2條帶滯后于孔道1條帶，說明質粒酶切完全。突變體線性模板的質量濃度為478.3 mg·L-1，A260/280比值為1.84；經(jīng)過純化后，產(chǎn)物的A260/280比值為1.81，純度更好，質量濃度為549.5 mg·L-1(表2)。線性質粒符合體外轉錄模板的要求。體外轉錄收獲50 μL洗脫產(chǎn)物，紫外分光光度計測定突變體cRNA的質量濃度為698.1 mg·L-1，A260/280比值為2.12，符合純度要求，可用于卵母細胞注射(表2)。

圖3 包含定點突變β4亞基序列的質粒測序結果和序列比較圖

AGT represents the base corresponding to the amino acid at position 168 of theβ4 subunit after mutation, and ATC represents the base corresponding to the amino acid at position 168 of theβ4 subunit before the mutation

表2 突變體質粒，線性DNA，cRNA的濃度和A260/280比值

2.4 突變型受體與本體由乙酰膽堿ACh激發(fā)的電流比較以相同濃度100 μmol·L-1ACh作用于非洲爪蟾卵母細胞1 s，引起了內向電流，說明α3β4和α3β4[I168S] nAChR受體模型成功表達。α3β4和α3β4[I168S] nAChR受體模型的電流大小如圖5所示，結果發(fā)現(xiàn)，相同條件下，本體對100 μmol·L-1ACh激動劑引發(fā)的開放電流為(690.4±136.5 )nA(n=6)，突變體對100 μmol·L-1ACh的誘發(fā)電流為(342.6±55.64)nA(n=15)，經(jīng)比較，2種電流差異顯著(P<0.05)。

2.5 突變型受體與本體的藥理活性檢測利用拮抗劑α-CTx RegIIA對α3β4 nAChR本體和突變體的活性進行研究(圖6)，紅色曲線代表本體的劑量反應曲線，黑色曲線代表突變體的劑量反應曲線，突變體向右移，證明受體的活性降低。從表3可知，α-CTx RegIIA對α3β4 nAChR本體IC50值為120 nmol·L-1，而對突變體α3β4[I168S]nAChR的IC50值較本體增大了1.4倍，為170 nmol·L-1。證明168位發(fā)生突變后，α-CTx RegIIA對α3β4 nAChR的結合活性減弱。

表3α-芋螺毒素RegIIA對本體和突變體的半阻斷濃度

Tab.3 TheIC50values for block of wildtype and mutant nAChRs byα-CTx RegIIA

受體類型nAChR subtypes半數(shù)阻斷濃度IC50 /(nmol·L-1)比值RatioHill系數(shù)Hillslopeα3β4120 10.8 α3β4[I168S]170 1.41.1

注：比值=突變體IC50/本體IC50

Note: ratio= mutantIC50/wildtypeIC50

3 討 論

不同亞型的nAChRs是許多疾病及相關新藥研發(fā)的重要靶點。因此，研究nAChRs各種亞型的精細結構對闡明nAChRs結構及功能的關系，揭示配體藥物與nAChRs相互作用的分子機制，以及研究nAChRs相關疾病的病理和生理過程至關重要。α3β4 是nAChRs中重要的1種亞型，它廣泛分布于外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內側韁核、腳間核、后屈束、松果體等組織中，主要參與調節(jié)突觸間多種神經(jīng)遞質的釋放[15]。吳勇等的研究結果表明，針對α3β4 nAChR亞型的選擇性阻斷劑AT-1001，18-MC和α-CTx AuIB能夠降低大鼠模型的煙堿釋放作用[16]；下丘腦中的α3β4 nAChR還參與煙堿介導的食欲降低過程[17]。此外，α3β4nAChR還與許多疾病的藥理和生理作用相關，如小細胞肺癌、機械性損傷修復、疼痛、成癮等。

β4亞基作為α3β4nAChR中的1個關鍵亞基，不僅參與生理和病理過程的調控，還是許多配體藥物作用的重要靶點。但是，目前藥物是如何通過β4亞基參與神經(jīng)調控的分子機制尚不清楚，而氨基酸定點突變技術可以確定β4亞基上關鍵氨基酸位點以及闡明藥物作用的精細分子機制。有研究表明：突變β4亞基 Loop F上D191，D192位天冬氨酸(Asp)會降低受體對激動劑Epi和CCh的活性，從而說明了在β4亞基和激動劑結合作用中，191，192位點是β4亞基上關鍵氨基酸位點[18]。本實驗利用PCR介導的定點突變技術，把位于β4亞基中與配體結合關鍵區(qū)域Loop F上的第168位異亮氨酸(Ile)，突變成了β2亞基中對應位點的絲氨酸(Ser)，該突變體對于研究α3β2和α3β4兩種亞型的敏感性差異具有重要意義。Ile突變成Ser后，氨基酸由非極性氨基酸轉變成極性氨基酸，疏水性發(fā)生了變化，導致該位點形成的口袋結構發(fā)生了變化，對激動劑和拮抗劑的活性也隨之改變。筆者選取激動劑ACh和拮抗劑α-CTx RegIIA研究突變體受體的藥理學活性，與本體比較，相同濃度ACh刺激突變受體激發(fā)的電流值比本體減小，α-CTx RegIIA對突變體活性減弱。該位點在其他激動劑和拮抗劑的結合中是否具有相同影響，還有待進一步研究。