陳耀麗，俞龍春，錢 悅，宋希強，張 哲,2

(1.海南大學 林學院/熱帶特色林木花卉遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，?？?570228；2.海南耀德農(nóng)業(yè)科技有限公司，海口 570228)

植物體是一個廣泛存在著各種生命物質(zhì)的微生態(tài)系統(tǒng)，微生物是其中的重要組成部分，它們分布于植物體內(nèi)外，種類及數(shù)量極為豐富，包括細菌、真菌、放線菌等，對于植物微生態(tài)系統(tǒng)平衡的維持起到重要的作用[1]。植物中的內(nèi)生菌是指其生活史的部分或全部階段均生活在植物內(nèi)部，并與植物建立了和諧共生、互利互惠關(guān)系的菌類，主要包括真菌和細菌，它們不僅可以促進植物的健康生長，還可控制植物病害的發(fā)生和發(fā)展，是重要的微生物資源[2]。內(nèi)生真菌是蘭科植物生長發(fā)育各個階段不可或缺的關(guān)鍵因素[3]，能夠直接參與植物根系甚至整株植物的生理代謝活動，保障植物的生長、個體間的競爭以及病原體的防護，而相應(yīng)地植物也會為真菌提供光合作用的產(chǎn)物[4-5]。內(nèi)生細菌也是蘭科植物內(nèi)生微生物的重要組成部分，研究表明內(nèi)生細菌能夠直接促進植物種子萌發(fā)、光合形態(tài)建成及生長發(fā)育[6-7]；此外，有些內(nèi)生細菌是促生細菌(Mycorrhiza helper bacteria)，能與菌根真菌特異性結(jié)合，刺激菌根真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長，能夠促進菌根真菌在宿主植物根部的定殖和生長，加強菌根化，從而間接促進植物生長及增強抗逆性[8-9]；有些內(nèi)生細菌還能釋放出拮抗物質(zhì)，可以阻止或減緩病原微生物的入侵，降低病蟲害的風險[10-11]。大尖囊蝴蝶蘭(Phalaenopsisdeliciosa)為多年生附生草本蘭科植物，廣泛分布于我國及東南亞的熱帶地區(qū)。筆者以大尖囊蝴蝶蘭新鮮營養(yǎng)根為實驗材料，對其內(nèi)生真菌和細菌進行分離與純化，并通過形態(tài)篩選和分子鑒定，旨在分析大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生真菌和細菌的組成及多樣性，并探討這些內(nèi)生真菌和細菌的開發(fā)價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料大尖囊蝴蝶蘭根部材料于2015年7月采自海南昌江霸王嶺國家級自然保護區(qū)，隨機選擇15個健康植株，每株剪取2個長約2 cm的根段，共采集30個根段。裝入PE管密封，帶回實驗室后24 h內(nèi)進行內(nèi)生真菌和細菌的分離。

1.2 內(nèi)生真菌和細菌的分離與純化內(nèi)生真菌方面：用自來水清洗干凈供試根段表面的污垢及附著物，無菌水沖洗30 s。75%乙醇分別消毒15，30，45和60 s，2%次氯酸鈉分別消毒30，60，90和180 s，之后用無菌水沖洗4次。消毒后的根段均勻切成0.3～0.5 cm的小段，接種于配制好的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。將得到的菌株繼續(xù)使用PDA培養(yǎng)基純化3次，并于28 ℃黑暗培養(yǎng)。將最后一次沖洗的無菌水涂布于PDA培養(yǎng)基中，做空白對照，用于檢測消毒是否徹底。采用斜面低溫保存法保存菌株，將純菌株接種至PDA斜面培養(yǎng)基上，于28 ℃下黑暗培養(yǎng)，待菌落長出，觀察無污染后，置于4 ℃的冰箱中保存，用于后續(xù)分子鑒定。

內(nèi)生細菌方面：用自來水清洗干凈供試根段表面的污垢及附著物，無菌水沖洗30 s并置于濾紙上晾干。將供試根段切成小段并稱取0.1 g，用75%乙醇分別消毒15，30，45和60 s，然后置于2%的次氯酸鈉消毒30，60，90和180 s，最后用無菌水沖洗4遍。將根段置于研缽中，加0.9 mL無菌水和適量石英砂，充分研磨后，用移液槍吸取勻漿液，經(jīng)梯度10-1，10-2，10-3，10-4和10-5g·L-1稀釋，取各濃度的漿液各50 μL，滴入配制好的NA培養(yǎng)基，每個處理重復(fù)3次。用滅菌后的涂抹棒將NA培養(yǎng)基上的漿液涂抹均勻，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。待有菌長出，根據(jù)菌落形態(tài)均勻、顏色、大小、透明度、邊緣整齊度以及菌苔的干濕程度等情況挑取具有代表性的菌落使用NA培養(yǎng)基連續(xù)純化3次。將最后一次沖洗的無菌水涂布于NA培養(yǎng)基中，做空白對照，用于檢測消毒是否徹底。本實驗中，10-1g·L-1濃度下細菌菌體相互覆蓋重疊，不利于挑選細菌；10-5g·L-1濃度下細菌數(shù)量較少，因此，選擇(10-2～10-4) g·L-1濃度的菌液進行保存處理。采用斜面低溫保存法保存菌株，將純菌株接種至NA斜面培養(yǎng)基上，于28 ℃下黑暗培養(yǎng)，待菌落長出，觀察無污染后，放于4 ℃的冰箱中保存，用于后續(xù)分子鑒定。

1.3 DNA提取及PCR擴增真菌DNA提?。簠⒖糋UO等[12]的改良CTAB法。細菌DNA提?。簩⒓兓募毦臃N到NA液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)(180 r·min-1) 1 d，之后使用細菌試劑盒(DP302-02, 北京天根生化科技有限公司)進行基因組DNA提取。

真菌擴增采用的引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。采用20 μL 的PCR反應(yīng)體系，包含6 μL ddH2O，各1 μL引物，1 μLTaq酶，1 μL DNA模板和10 μL 2×PCRmix；反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，之后35個循環(huán)(包括94 ℃變性30 s, 55 ℃復(fù)性45 s, 72 ℃延伸1 min)，最后72 ℃延伸10 min。

細菌采用16S rDNA通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。采用50 μL PCR反應(yīng)體系，包含19 μL ddH2O，各2 μL引物，2 μLTaq酶，2 μL DNA模板和25 μL 2×PCRmix；反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min，之后35個循環(huán)(包括94 ℃變性1 min; 55 ℃復(fù)性1 min; 72 ℃延伸1.5 min)，最后72 ℃延伸10 min。

1.4 PCR產(chǎn)物檢測及測序PCR產(chǎn)物檢測采用1.6%瓊脂糖進行電泳檢測，選取條帶清晰的PCR產(chǎn)物，委托北京諾賽基因組研究中心有限公司Sanger測序?qū)嶒炇覝y序。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析將測序得到的ITS或16s rDNA序列匯總成本地數(shù)據(jù)庫，用QIIME 1.8.0完成序列的預(yù)處理和可操作分類單元(Operational taxonomic units, OTUs)的劃分及代表序列挑選[13-14]。將OTU代表序列在GenBank中進行在線BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)比對，分別將相似性大于99%，介于95%和99%的序列列為參考種和參考屬[15]。采用鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹[16-17]?？瘴槐痪幋a為丟失數(shù)據(jù)，Bootstraps值設(shè)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌和細菌的分離與純化最佳表面消毒時間：以對照組是否殘余菌落的最低消毒時間為原則，真菌方面使用75%乙醇消毒30 s，之后用2%次氯酸鈉消毒90 s為最佳消毒組合(表1)。細菌方面以75%乙醇消毒30 s，2%次氯酸鈉浸泡30 s為最佳消毒組合。菌株數(shù)量：通過分離純化培養(yǎng)，共獲得代表性內(nèi)生真菌菌株38株，內(nèi)生細菌菌株54株。

2.2 內(nèi)生真菌的分子鑒定38株代表性內(nèi)生真菌菌株經(jīng)分子鑒定可劃分為5個OTUs (Pd-fun1～Pd-fun5) (表1)，隸屬于1門2綱4目4科5屬，包括球二孢屬(Lasiodiplodia)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、假赤殼屬(Pseudocosmospora)和多絲菌屬(Setophoma)。其中優(yōu)勢屬為球二孢屬，占總菌株數(shù)的33.33%；次優(yōu)勢屬為曲霉屬，占26.68% (表1)。代表性內(nèi)生真菌菌株形態(tài)(圖1)，系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。

表1 大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生真菌代表性菌株序列的相似性比較

Tab.1 rDNA-ITS sequence similarity between representative strains and reference taxa of the endophytic fungi inPhalaenopsisdeliciosa

操作單元OTU科Family屬Genus參考物種Close relative登錄號Accession No.同源性/%Identity相對分離比例/%Relative isolation proportion Pd-fun1AspergillaceaeAspergillusAspergillus nigerKT726919.19926.68Pd-fun2BotryosphaeriaceaeLasiodiplodiaLasiodiplodia pseudotheobromae KT728915.110033.33Pd-fun3NectriaceaeFusariumFusarium keratoplasticumKT716207.1996.68Pd-fun4NectriaceaePseudocosmosporaPseudocosmospora viliorKP050600.19913.33Pd-fun5PhaeosphaeriaceaeSetophomaSetophoma terrestrisKP191631.19920.00

圖1 大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生真菌代表菌株的菌株形態(tài)

圖2 大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生真菌ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 內(nèi)生細菌的分子鑒定54株代表性內(nèi)生細菌菌株經(jīng)分子鑒定可劃分為17個OTUs (Pd-bac1～Pd-bac17) (表2)，隸屬3門5綱6目9科12個屬，分別是無色菌屬(Achromobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、不動細菌屬(Acinetobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、泛菌屬(Pantoea)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)。其中優(yōu)勢屬為芽孢桿菌屬，占總菌株數(shù)的24.07%，次優(yōu)勢屬為腸桿菌屬，占16.67%(表2)。部分代表性內(nèi)生細菌菌株形態(tài)(圖3)，系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。

表2 大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生細菌代表性菌株序列相似性比較

圖3 大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生細菌的代表菌株形態(tài)

圖4 大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生細菌16s rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

本研究的大尖囊蝴蝶蘭根部內(nèi)生真菌的分離率較低，與其他研究結(jié)果相似，都反映了熱帶附生蘭科植物內(nèi)生真菌的低侵染率[18]。對很多附生蘭科植物而言，菌絲團的分離相當困難，因為其根系并沒有被菌根真菌大量侵染[19]。尤其是在熱帶地區(qū)，附生蘭科植物中觀察到的菌絲團往往很快就會被消解掉[20]。

大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生真菌的5個OTUs均屬于子囊菌門(Ascomycetes)，其中優(yōu)勢屬為球二孢屬(Lasiodiplodia)和曲霉屬(Aspergillus)。目前研究表明，大部分的蘭科植物內(nèi)生真菌都屬于擔子菌門(Basidiomycete)和子囊菌門(Ascomycetes)[21]。盡管目前普遍認為蘭科植物大都與絲核菌類(Rhizoctonia-like fungi)真菌共生，主要涉及擔子菌門的角擔菌科(Ceratobasidiaceae)、膠膜菌科(Tulasnellaceae)和蠟殼菌科(Sebacinaceae)，這些類群被歸為菌根內(nèi)生真菌[22]。但近年來不斷有研究發(fā)現(xiàn)擔子菌門的其他種類，甚至子囊菌門真菌也可以與蘭科植物形成蘭科菌根[22]。另外，子囊菌門也是蘭科植物中分離頻率最高的內(nèi)生真菌[23]。陳娟等[24]研究了5種藥用蘭科植物的可培養(yǎng)內(nèi)生真菌多樣性，241株菌株被鑒定屬于子囊菌門，僅有10株菌株屬于擔子菌門。陳娟等[25]、王亞妮[26]發(fā)現(xiàn)蘭科石斛屬(Dendrobium)中分離出的大部分內(nèi)生真菌同樣屬于子囊菌門(約占總種類的80%)，僅有少數(shù)屬于擔子菌門?？潞｛惖萚27]從五唇蘭(Phalaenopsispulcherrima)根部分離到的內(nèi)生真菌大部分也屬于子囊菌門。

盡管非菌根內(nèi)生真菌與蘭科植物是否存在共生關(guān)系還不明確，但有研究表明許多非菌根內(nèi)生真菌也具備多方面的促生能力，是不可忽視的微生物資源。例如，子囊菌門鐮刀菌屬的部分種類可刺激蘭花種子發(fā)芽[28]；帥紅艷[29]發(fā)現(xiàn)鐮刀菌對鐵皮石斛(Dendrobiumcatenatum)幼苗也具有促生作用；Chen等[30]發(fā)現(xiàn)鐮刀菌能提高環(huán)草石斛(D.loddigesii)的生長速度和生物量。Wang等[31]從華石斛(D.sinense)根部分離到的木霉屬(Trichoderma)菌株能夠極顯著促進華石斛組培苗的生長，能夠協(xié)助華石斛植株提高礦質(zhì)營養(yǎng)和內(nèi)源激素含量，并提高光合性能。本研究從大尖囊蝴蝶蘭的根部分離到的鐮刀菌屬真菌可能極具開發(fā)潛力，球二孢屬和炭角菌屬也是蘭科植物中常見的內(nèi)生真菌，其與蘭科植物的關(guān)系還需要進一步探索。

蘭科植物內(nèi)生細菌方面的研究也是內(nèi)生微生物研究的熱點問題之一，目前從蘭科植物的不同器官(根、莖、葉等)均成功分離到了內(nèi)生細菌。據(jù)不完全統(tǒng)計，這些內(nèi)生細菌隸屬于近60屬[32]。本研究的大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生細菌菌株劃分為17個OTUs，隸屬12個屬，其中優(yōu)勢屬為其芽孢桿菌屬(Bacillus)和腸桿菌屬(Enterobacter)。與已報導(dǎo)的蘭科物種比較，大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生細菌多樣性較高，例如，華石斛根部分離出的內(nèi)生細菌僅有7個屬，優(yōu)勢屬是芽孢桿菌屬[33]；從五唇蘭(P.pulcherrima)根部分離的內(nèi)生細菌有芽孢桿菌屬、伯克氏菌屬、草酸菌屬(Pandoraea)等7個屬，其中優(yōu)勢屬為芽孢桿菌屬[7]。Wilkinson等[34]研究了13種地生蘭的內(nèi)生細菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬(Pseudomonas)細菌是最優(yōu)勢屬，并認為蘭科植物內(nèi)生細菌的種類和數(shù)量會隨生境、宿主種類和根齡的不同而變化。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，附生蘭與地生蘭的內(nèi)生細菌種類有所差異，其中附生蘭的基生根與氣生根內(nèi)的細菌種類也不同，而氣生根內(nèi)的細菌更豐富，也更適合細菌的定殖[35]。

內(nèi)生細菌對蘭科植物具有多種多樣的促生作用。從杓唇石斛(Dendrobiummoschatum)根部分離的鞘氨醇菌屬(Sphingomonas)和分枝菌屬(Mycobacterium)細菌可顯著提高種子的萌發(fā)率[6]；芽孢桿菌屬細菌則被證明可以防治葉斑病[11]、產(chǎn)IAA[36]、促進種子的萌發(fā)和植株生長[7]；土壤桿菌屬、類芽孢桿菌屬、泛菌屬和伯克氏菌屬等菌種也發(fā)現(xiàn)具有促進植株生長的作用[7]；念珠藍細菌屬(Nostoc)兼具固氮和光合作用等[37]。因此，從大尖囊蝴蝶蘭根部分離到的芽孢桿菌屬細菌可能極具開發(fā)潛力，假單胞菌屬、土壤桿菌屬、類芽孢桿菌屬、泛菌屬和伯克氏菌屬等菌種也具一定的研究價值，在今后的工作中，應(yīng)重點關(guān)注這些類群與大尖囊蝴蝶蘭的互利共生機理。

致謝：海南霸王嶺林業(yè)局王進強工程師在野外試驗中提供了幫助；海南大學吳文碟、吳姝漪和李靜靜在微生物分離和純化方面提供了指導(dǎo)和協(xié)助，一并致謝！