王 群，曾曉玲，余 蕾，趙淑云

（1.貴州醫(yī)科大學，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院產(chǎn)科，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，貴州 貴陽 550004；4.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院生殖中心，貴州 貴陽 550004）

目前出生缺陷逐漸成為嬰兒死亡的主要原因以及導致兒童殘疾的重要原因。2012年在《中國出生缺陷防治報告》中統(tǒng)計顯示：我國是出生缺陷的高發(fā)國家，我國出生缺陷的發(fā)生率約為5.6%，每年約有25萬例在出生時有明顯臨床可見出生缺陷。臨床常見染色體異常遺傳疾病有唐氏綜合征(21-三體)、愛德華綜合征(18-三體)、Patau綜合征(13-三體)、Turner綜合征(45,X)、Klinefelter綜合征(47,XXY)，在產(chǎn)前診斷疾病中約占80%。2013年在《全國婦幼衛(wèi)生信息分析報告》中顯示：先天性心臟病、多指（趾）、總唇裂、先天性腦積水以及馬蹄內(nèi)翻在2012年出生缺陷患兒中位居前5位。很多染色體微缺失、微重復異?？蓪е滦律鷥撼霈F(xiàn)上述缺陷。據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計，不明原因的智力低下、多發(fā)畸形及發(fā)育遲緩中約有12%是由染色體微缺失/微重復所致。目前則主要通過實施產(chǎn)前檢測技術(shù)對出生缺陷進行篩查，并采取相應干預措施以降低出生缺陷的發(fā)生率。

1 產(chǎn)前檢測技術(shù)的發(fā)展

產(chǎn)前篩查常用方法有：血清學篩查（二聯(lián)法檢出率為71%，假陽性率為5%；三聯(lián)法檢出率71%，假陽性率5%；四聯(lián)法檢出率83%，假陽性率8%[1]）、產(chǎn)前超聲測定胎兒頸項透明層 (NT)厚度、系統(tǒng)超聲等。對于孕母血清學篩查高風險患者則需進一步行侵入性產(chǎn)前診斷（羊水穿刺、臍血穿刺、胎兒鏡）。目前最為廣泛應用的的血清學篩查技術(shù)因其較低的檢出率導致出生缺陷發(fā)生率增加，侵入性手段會導致流產(chǎn)（絨毛穿刺：1%～3%。羊膜腔穿刺：0.2%～0.5%、臍靜脈穿刺：1%～2%）、宮內(nèi)感染等不良妊娠結(jié)局[2]，且絨毛取樣還存在不能回避限制性胎盤嵌合問題的弊端[3]。兩者均在經(jīng)濟及精神方面為社會及家庭帶來沉重負擔，且較高的假陽性率增加了不必要的侵入性產(chǎn)前診斷，增加了正常胎兒丟失的風險，降低了產(chǎn)前診斷的依從性[4]。因此，人們希望一種快速、準確且無創(chuàng)的產(chǎn)前檢測方法的誕生。

隨著分子生物學檢測技術(shù)的迅速發(fā)展，在1997年有學者在孕婦外周血中檢測到胎兒游離DNA(cell-free fetalDNA,cffDNA)并且應用于檢測胎兒性別以篩查與性別相關(guān)疾病的胎兒。cffDNA幾乎全部來源于胎盤滋養(yǎng)層細胞，最早可在妊娠第4周的母體外周血中被檢測出來，在妊娠7周胎兒胎盤循環(huán)建立后，cffDNA即在母體外周血中以一定的比例穩(wěn)定存在，且可達到檢測的濃度要求[5]。在孕10周后可在幾乎所有的孕婦外周血中檢測出[3]。cffDNA在母體血漿游離DNA總量中僅占5%～30%,其隨孕周的增大而增多。cffDNA片段大小為75～250bp，分娩后母體外周血中cffDNA可快速降解，故多孕次孕婦的產(chǎn)前診斷結(jié)果不受前一次妊娠時cffDNA的干擾[4]。此種方法是通過抽取孕婦外周血進行檢測，是一種無創(chuàng)的產(chǎn)前檢測方法。

隨著高通量測序技術(shù)（ next generation sequencing,NGS）的發(fā)明與發(fā)展，孕婦外周血行胎兒非整倍體評估的NIPT技術(shù)使產(chǎn)前篩查步入更為廣闊的發(fā)展空間。NIPT主要的檢測范圍為胎兒的21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征，與傳統(tǒng)的血清學篩查相比較而言有著更高的準確性及更低的假陽性率。且已在臨床應用中取得顯著成效。在2012年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學會(the American college of obstetricians and gynecologists,ACOG)及美國母胎醫(yī)學學會(the Society for maternal-fetal medicine,SMFM)均推薦NIPT作為非整倍體高危人群的一種初篩檢測。因NIPT具有高敏感性、高特異性、低假陽性率及無創(chuàng)性等優(yōu)點使其在國內(nèi)外廣泛應用于臨床。

2 NIPT在胎兒染色體微缺失微重復檢測的研究進展

隨著高通量測序深度的提高，NIPT技術(shù)得到了進一步的拓展，且國內(nèi)外學者對其進行了大量的臨床研究。2011年新英格蘭醫(yī)學雜志中有學者報道了首例無創(chuàng)產(chǎn)前診斷胎兒微缺失綜合征；Waper[6]等于研究中發(fā)現(xiàn)胎兒22q11.2缺失的檢出率為97.8%，假陽性率為0.76%；1p36缺失、Cri-duchat綜合征、Prader-Willi綜合征及Angelman綜合征的檢出率均為100%，假陽性率為0%。盡管染色體微缺失/微重復綜合征的發(fā)病率目前還不是非常明確，但有研究發(fā)現(xiàn)染色體微缺失/微重復在母體染色體正常的胎兒中發(fā)生率也可達1%～1.7%。相關(guān)臨床研究表明：核型正常的情況下，6% B超顯示異常和1.7%高齡或唐篩陽性的病例中存在致病性染色體拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV)。然而與染色體非整倍體疾病不同，致病CNV的發(fā)生風險與孕婦年齡并沒有密切的關(guān)聯(lián)，提示針對低齡孕婦（三大常染色體非整倍體的低風險人群）中胎兒可能出現(xiàn)致病CNV的風險目前是被忽視的。依托高通量測序技術(shù)，通過對孕婦外周血中胎兒游離DNA的檢測，盡可能多的判斷胎兒染色體疾病已成為行業(yè)風向，并在世界范圍內(nèi)被應用于實踐?；谝陨涎芯浚鞔髧H機構(gòu)均擴大了NIPT的篩查范圍。2015年，意大利報道了第一例應用Panorama TM Plus檢測出胎兒DiGeorge綜合征。趙永和[7]等發(fā)現(xiàn)：NIPT檢測結(jié)果顯示13號、18號染色體微缺失病例各一例，18號染色體微重復病例經(jīng)染色體微陣列分析(Chromosomal Microarray Analysis CMA)證實為陽性結(jié)果。但近年，有相關(guān)學者研究發(fā)現(xiàn)了NIPT在篩查微缺失微重復層面存在的假陰性/陽性病例。池一嬋[8]等人的研究中發(fā)現(xiàn)一例NIPT提示CHr18長臂末端存在缺失及重復，而微陣列比較基因組雜交（array based comparative genomic hybridization，Array-CGH）檢測結(jié)果顯示缺失而未見重復，胎兒引產(chǎn)后取臍靜脈血行基因檢測結(jié)果顯示缺失，未見重復，死胎外觀雙手重疊指、耳位底、貫通掌，尸檢見肝大、多囊腎等異常。此項研究中還顯示NIPT檢測假陽性病例4例（7號染色體偏多），經(jīng)Array-CGH檢測及超聲隨訪均未見異常，產(chǎn)后新生兒表型正常；假陰性病例1例，因超聲提示脛骨發(fā)育異常行NIPT提示未見異常，繼而行Array-CGH檢測及核型分析，核型分析結(jié)果未見異常，Array-CGH檢測結(jié)果提示10q11.22區(qū)段微重復，而此區(qū)段微重復可導致骨骼發(fā)育異常。周靜[9]等人報道1例NIPT陰性的病例，在新生兒出生后表現(xiàn)為頸后皮膚后綴、鼻梁低平，經(jīng)核型分析及Array-CGH檢測均證實為4號染色體短臂缺失，為WOLF綜合征； 胡芷陽[10]等人的研究中證實1例假陽性病例，該病例母親血測序發(fā)現(xiàn)有微重復情況。有研究發(fā)現(xiàn)：NIPT可檢測300kb以上胎兒基因組微缺失/微重復，然而對于小于300kb的片段則可出現(xiàn)假陰性或假陽性[11]。目前普遍采用的NIPT計算模式假設(shè)所有母親全部片段的DNA拷貝數(shù)是一致的，因此如果母體有缺失或重復時，就可能造成NIPT結(jié)果的假陽性或假陰性。故對于NIPT篩查出的微缺失/微重復必須行進一步產(chǎn)前診斷來明確診斷，以排除假陰性/假陽性導致的胎兒不良結(jié)局。柯瑋琳[12]等應用Array-CGH證實染色體核型分析對CNV總的漏診率為46.2%。較高的漏診率表明染色體核型分析在CNV層面上具有明顯的局限性。染色體核型分析技術(shù)雖為最經(jīng)典和常見的診斷方法，但分辨率較低，一般只能檢測出10Mb以上的重復、缺失、易位等結(jié)構(gòu)異常，幾乎所有＜5MB染色體不平衡畸變不能被染色體核型分析識別。Array-CGH為診斷CNV提供了高分辨率全基因組篩選，并且可以被用于檢測未知基因組DNA片段的增減，但Array-CGH 不能檢測出平衡易位、倒位等不存在染色缺失、重復的結(jié)構(gòu)異常，也不能檢測出多倍體及低比例嵌合[13]， 故NIPT篩查出的微缺失/微重復病例可進一步行染色體核型分析及Array-CGH檢測明確診斷，兩者結(jié)合可降低CNV的漏診率。

有公司推出覆蓋常見的三大染色體、性染色體及高發(fā)微缺失微重復綜合征的無創(chuàng)檢測項目。微缺失/微重復綜合征主要包括以下7種：22q11.2 deletion 綜合征（含Digeorge綜合征）、1p36 deletion 綜合征、2q33.1 deletion 綜合征、Cri-Du-Chat綜合征、Langer-Giedion綜合征、Angelman綜合征、Prader-Willi 綜合征。截止2016年6月在DECIPHER數(shù)據(jù)庫中收錄關(guān)于有明確CNV注釋的疾病，其中有命名的染色體微缺失/微重復綜合征達70余種，病例達50000多例。但國際產(chǎn)前診斷學會（international society for prenatal diagnosis,ISPD）表示NIPT擴展檢測應當局限于在研究清楚的微缺失/微重復綜合征范圍內(nèi)，且需要結(jié)合臨床。因NIPT存在假陽性、假陰性結(jié)果，NIPT檢測出的染色體微缺失/微重復病例應結(jié)合B超隨訪結(jié)果、染色體核型分析及染色體微陣列分析/Array-CGH檢測結(jié)果綜合分析后決定胎兒的存留，而對于陰性結(jié)果則應超聲隨訪，必要時行產(chǎn)前診斷明確是否存在CNV。因CNV存在基因多態(tài)性，且并非所有檢測出的微缺失/微重復均可致病，故應慎重向家屬解釋染色體微缺失/微重復結(jié)果，且現(xiàn)仍缺少大規(guī)模的前瞻性臨床檢測數(shù)據(jù)，應慎重應用于常規(guī)產(chǎn)前篩查。