張宇軍，曹 慧，徐 斐，袁 敏，葉 泰，于勁松

（上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093）

枯草芽孢桿菌中性蛋白酶可裂解蛋白質中亮氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸形成的肽鍵，是溫和的蛋白質水解內切酶，具有催化效率高、專一性強及污染低等優(yōu)點。枯草芽孢桿菌中性蛋白酶已經在食品和生物制品行業(yè)中得到廣泛的應用。但傳統(tǒng)的游離酶存在成本高、不穩(wěn)定及難回收等缺陷，這些缺陷在很大程度上限制了枯草芽孢桿菌中性蛋白酶的應用[1-2]。由于固定化酶比傳統(tǒng)的自由酶更有優(yōu)勢，所以固定化酶的固定化技術[3-5]引起化學生物學、生物工程醫(yī)學及生命科學等領域研究者的高度重視，經過近幾十年的研究，不僅提升了特性而且拓展了應用領域[6-10]。因而，很多研究將枯草芽孢桿菌中性蛋白酶固定于載體之上，制成固定化酶，從而有效解決游離酶成本高及不穩(wěn)定等問題。固定化載體的開發(fā)也日新月異，逐漸在生產中發(fā)揮不可替代的作用[11-14]。

本課題組在前期的研究中采用CASTp 蛋白表面三維結構計算平臺確定了枯草芽孢桿菌中性蛋白酶的親和配基結合區(qū)域，該區(qū)域由SER-358，LEU-359，ASP-360，ASP-399，GLU-401，GLU-407和ASP-408 組成，且位于活性區(qū)域的背面。再通過AutoDock Vina 和AutoDock 4.2 分子對接軟件從Zinc 數(shù)據(jù)庫中篩選出了對該結合區(qū)域有特異性結合能力的小分子配基[15-17]。經過兩輪篩選，發(fā)現(xiàn)葡萄糖酸冼必泰對枯草芽孢桿菌中性蛋白酶有較大的親和力，其結合能達到-12.96 kcal/mol。因此，在前期實驗的基礎上，采用酰胺交聯(lián)法將葡萄糖酸冼必泰偶聯(lián)到弱酸性陽離子交換樹脂上，制成親和載體，再進一步將枯草芽孢桿菌中性蛋白酶偶聯(lián)到親和載體上，制備出固定化酶，并對其酶學性質進行研究。與傳統(tǒng)方法相比，由該方法制備的親和載體對酶的親和力更高，酶的活性區(qū)域也得以充分暴露，因而具有穩(wěn)定性好、催化效率高及操作簡單等優(yōu)點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌中性蛋白酶，湖北盛天恒創(chuàng)生物科技責任有限公司；丙烯酸型DIAION WK40 樹脂，北京綠百草科技有限公司；干酪素，國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖酸冼必泰，美國Alfa-Aesar公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES），國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

酶反應器，自制；PHS-3E 型pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；UV-6000 PC 型紫外-可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；KW-1000DB 水浴恒溫振蕩器，金壇市科析儀器有限公司；EYELA A-3S 水流抽氣機，上海愛明儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 弱酸性陽離子交換樹脂的預處理 將弱酸性陽離子交換樹脂置于70 ℃雙蒸水中攪拌清洗3次；按照1∶1.5 的比例在樹脂中加入一定體積0.55 mol/L 的鹽酸溶液，置于30 ℃，150 r/min 的水浴中振蕩45 min，反應完畢后用蒸餾水將樹脂沖洗至中性；再按照上述步驟，依次采用相同濃度的氫氧化鈉和鹽酸進行處理；將預處理過的弱酸性陽離子交換樹脂置于雙蒸水中備用。

1.3.2 弱酸性陽離子交換樹脂交換通量的測定稱取三份弱酸性陽離子交換樹脂，分別置于干燥的具塞三角燒瓶中，向每個三角燒瓶中加入100 mL、0.1 mol/L 氫氧化鈉標準溶液，搖勻，將瓶蓋蓋嚴，放至在60 ℃水浴鍋中反應2 h，反應完畢后取出，冷卻至室溫。從具塞三角燒瓶中取出25 mL 反應液（不得吸出樹脂顆粒）置于三角燒瓶中，再加入50 mL 雙蒸水和3 滴酚酞指示劑。用0.1 mol/L 的鹽酸標準滴定反應液至微紫紅色，且保持15 s 不褪色，即為終點，同時進行空白試驗。計算弱酸性陽離子交換樹脂的交換通量為

式中：Qt為弱酸性陽離子交換樹脂的交換通量，mmol/g；V1，V2分別為空白組和實驗組消耗的鹽酸標準溶液的體積，mL；CHCL為鹽酸標準溶液的濃度，mol/L；M 為弱酸性陽離子交換樹脂的質量，g。

1.3.3 枯草芽孢桿菌中性蛋白酶活力測定

1）游離枯草芽孢桿菌中性蛋白酶酶活力的測定 酪氨酸標準曲線的建立：稱取預先于105 ℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1 g，用60 mL、0.1 mol/L 鹽酸溶解后定容至100 mL，即得1 mg/mL 酪氨酸母液。取酪氨酸母液，配成不同濃度的標準溶液（10，20，30，40，50 μg/mL），并于波長275 nm 處測定其吸光值。以吸光值為縱坐標，酪氨酸濃度為橫坐標，繪制出標準曲線。

枯草芽孢桿菌蛋白酶酶活力的測定：將10 mg枯草芽孢桿菌中性蛋白酶溶于100 mL、0.02 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH 7.5）中，各取2 mL 酶液和酪蛋白溶液，混勻，并在30 ℃條件下反應10 min，加入4.00 mL 三氯乙酸，靜止過濾，取濾液于波長275 nm處測定其吸光值為

式中：X 為酶活力，U/g（U/mL）；A 為吸光值；K 為吸光常數(shù)；4 為反應總體積，mL；10 為反應時間10 min；n 為稀釋倍數(shù)；E 為紫外法與福林法的換算系數(shù)，取0.5。

2）固定化枯草芽孢桿菌中性蛋白酶酶活力的測定 取0.05 g 左右的固定化枯草芽孢桿菌中性蛋白酶，將其置于2 mL 的磷酸緩沖溶液（0.02 mol/L，pH 7.5）中；再向其中添加2mL 酪蛋白溶液，在30℃下反應10 min，加入4.00 mL 三氯乙酸，靜止過濾，取濾液于波長275 nm 處測定其吸光值為

式中：X 為酶活力，U/g 樹脂；M 為固定化酶質量，g；其他同上。

1.3.4 葡萄糖酸冼必泰在載體上的修飾及表征

1）葡萄糖酸冼必泰在載體表面的修飾 將6 g預處理好的弱酸性陽離子交換樹脂載體加入到30 mL 含有10.00 g 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和4.00 g N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）的2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）緩沖溶液中（0.1 mol/L，pH 6.0），并在25 ℃條件下攪拌活化0.5 h?；罨戤吅?，以蒸餾水清洗樹脂，直至上清液無紫外吸收，再抽干活化載體中的殘余水分；在活化的載體中加入6.5 mL、0.725 mmol/L 的葡萄糖酸冼必泰溶夜，并在25 ℃、140 r/min 的恒溫振蕩水浴中反應12 h。反應完畢后，采用蒸餾水洗去未交聯(lián)的葡萄糖酸冼必泰，直至上清液無紫外吸收，即獲得修飾有葡萄糖酸冼必泰的親和載體。

在上述實驗條件下，考察葡萄糖酸冼必泰添加量（0.095、0.181、0.362、0.725、1.45、2.9 mmol/L）、載體活化時間（0.25、0.5、1、2 h）及載體羧基與EDC 摩爾比例（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4）對枯草芽孢桿菌中性蛋白酶固定化效果的影響。

2）修飾有葡萄糖酸冼必泰的載體表征 葡萄糖酸冼必泰修飾量的測定：樹脂活化反應完成后取上清液，利用紫外分光光度法測定上清液中葡萄糖酸冼必泰的濃度，并根據(jù)反應前后的濃度差計算葡萄糖酸冼必泰的修飾量。

傅立葉變換紅外光譜：取適量冷凍干燥后的空白樹脂和修飾有葡萄糖酸冼必泰的親和載體，分別與溴化鉀一起置于瑪瑙研缽中，研磨成粉后裝樣壓片。采用紅外光譜儀在500～4 000 cm-1區(qū)間內對樣品進行掃描，獲得傅立葉紅外光譜圖。

1.3.5 枯草芽孢桿菌中性蛋白酶在親和載體上的固定及表征 配置600 μ0/mL 的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶液，添加到15 mL 含有1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）的交聯(lián)溶液中，混合均勻。將溶液置于25 ℃，110 r/min 的恒溫振蕩器中反應1 h，再加入0.5 g 修飾葡萄糖酸冼必泰的親和載體，繼續(xù)振蕩反應12h。采用蒸餾水分別洗去未交聯(lián)的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶、EDC 和NHS，即得固定化枯草芽孢桿菌中性蛋白酶。

在上述實驗條件下，研究加酶量（75、150、300、600、900、1 200、1 500 U），EDC添加量（3.4、6.8、13.7、27.4、54.8、137 mg）對枯草芽孢桿菌中性蛋白酶固定化效果的影響。

傅立葉變換紅外光譜：取適量游離枯草芽孢桿菌中性蛋白酶和固定化枯草芽孢桿菌中性蛋白酶，分別與溴化鉀一起置于瑪瑙研缽中，研磨成粉后裝樣壓片。采用紅外光譜儀在500～4 000 cm-1區(qū)間內對樣品進行掃描，獲得傅立葉紅外光譜。

1.3.6 固定化酶、游離酶及隨意固定化酶米氏常數(shù)（Km）的測定 配置濃度為0.1%、0.125%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%的酪蛋白底物溶液。分別測定固定化酶、游離酶和隨意固定化酶在各底物濃度下的反應初速度。按照Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法作圖原理，測出這幾種酶的Km 值。

隨意固定化酶的制備工藝：稱取0.5 g 預處理好的弱酸性陽離子交換樹脂，將其加入到15 mL、400 μg/mL 的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶液中，在25℃，110 r/min 水浴振蕩器中反應12 h。反應完成后，以蒸餾水洗去未吸附的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶，即得隨意固定化枯草芽孢桿菌中性蛋白酶。

2 結果與分析

2.1 弱酸性陽離子交換樹脂的交換通量的確定

采用酸滴定方法對弱酸性陽離子交換樹脂的交換通量進行了測定。結果表明，弱酸性陽離子交換樹脂的交換通量為2.9 mM/g 樹脂，即每克弱酸性陽離子交換樹脂含有2.9 mmol 的羧基。

2.2 葡萄糖酸冼必泰在載體上的修飾

2.2.1 葡萄糖酸冼必泰添加量對親和載體修飾量及固定化酶活的影響 在載體羧基與EDC 的摩爾比例為1∶3，載體活化時間為0.5 h，加酶量為900 U的條件下，考察了葡萄糖酸冼必泰添加量（0.095、0.181、0.362、0.725、1.45、2.9 mmol/L）對其在載體上的修飾量及固定化酶活力的影響。結果見圖1。

圖1 葡萄糖酸冼必泰添加量對載體配基修飾量及枯草芽孢桿菌中性蛋白酶固定化效果的影響Fig.1 Effects of Chlorhexidine concentration on ligands modify quantity of the carrier and the activity of oriented neutral protease

由圖1 可知，隨著葡萄糖酸冼必泰添加量的增加，載體上葡萄糖酸冼必泰的修飾量也隨之增加。當葡萄糖酸冼必泰的添加量達到3 mmol/L 時，載體上配基修飾量達到最大，為165 μg/g 樹脂。隨著葡萄糖酸冼必泰添加量的增加，固定化酶酶活力呈減小的趨勢，當葡萄糖酸冼必泰添加量為0.095 mmol時，即載體上修飾的配基量為42 μmol/g 時，固定化酶酶活力最大，達到314 U/g 數(shù)脂。葡萄糖酸冼必泰的添加量與其固定的酶分子量并不成正比，這可能是由于隨著葡萄糖酸冼必泰添加量的增加，載體上葡萄糖酸冼必泰的修飾量相應增大，過量修飾的配基反而形成空間位阻，使枯草芽孢桿菌中性蛋白酶不能充分與親和載體交聯(lián)，從而降低了酶活力。因此選取葡萄糖酸冼必泰的添加量為0.095 mmol。

2.2.2 載體活化時間對枯草芽孢桿菌中性蛋白酶固定化效果的影響 在葡萄糖酸冼必泰添加量0.095 mmol/L，載體羧基與EDC 摩爾比為1∶3，加酶量900 U 的條件下。考察了載體活化時間（0.25、0.5、1、2 h）對其在載體上的修飾量及固定化酶活力的影響。結果如圖2 所示。

圖2 載體活化時間對載體配基修飾量及固定化效果的影響Fig.2 Effects of activation time on ligands modify quantity of the carrier and the activity of immobilizated neutral protease

由圖2 可知，隨著載體活化時間的增加，載體上葡萄糖酸冼必泰修飾量也隨之增加；當載體活化時間為2 h 時，葡萄糖酸冼必泰在載體上的修飾量達到最大，為52 μg/g 樹脂。隨著載體活化時間的增加，固定化酶活力呈先增加后減小的趨勢。當載體活化時間為1 h 時，固定化酶酶活力達到最大，為364 U/g 樹脂。載體的活化時間與其固定的酶分子量并不成正比。這是由于隨著活化時間的增加，載體羧基活化生成的酯被水解，導致交聯(lián)的酶分子量下降[18]。因此選取樹脂活化時間為1 h。

2.2.3 載體羧基與EDC 摩爾比對枯草芽孢桿菌中性蛋白酶固定化效果的影響 在葡萄糖酸冼必泰添加量0.095 mmol/L，載體樹脂活化時間1 h，加酶量900 U 的條件下，考察載體羧基與EDC 摩爾比（1∶1，1∶2，1∶3，1∶4）對其在載體上的修飾量及固定化酶活力的影響。結果如圖3 所示。

由圖3 可見，隨著EDC 與載體羧基摩爾比例的增加，載體上葡萄糖酸冼必泰的修飾量也隨之增加；隨著EDC 與載體羧基摩爾比例的進一步增加，葡萄糖酸冼必泰的修飾量呈平穩(wěn)的趨勢；當載體羧基與EDC 摩爾比為1∶4 時，載體上修飾的配基量達到最大，為46 μg/g 樹脂。隨著載體羧基與EDC 摩爾比例的增加，固定化酶活力呈先增加后減小的趨勢。在載體羧基與EDC 摩爾比為1∶3 時固定化酶活力最大，達到364 U/g 樹脂。這是由于當EDC 濃度較低時，活化的葡萄糖酸冼必泰較少，載體上固定化酶的量也較少；隨著EDC 濃度的增加，活化的葡萄糖酸冼必泰也隨之增加，為中性蛋白酶的固定提供了較多的結合位點；隨著EDC 濃度的進一步增加，過量活化的葡萄糖酸冼必泰會使大量的酶結合在載體表面，酶分子之間相互擠壓，導致酶的活性位點被覆蓋，從而降低了固定化酶活力。因此選擇載體羧基與EDC 摩爾比為1∶3。

圖3 載體羧基與EDC 摩爾比對載體配基修飾量及枯草芽孢桿菌中性蛋白酶固定化效果的影響Fig.3 Effects of activation proportion on ligands modify quantity of the carrier and the activity of immobilizated neutral protease

2.2.4 葡萄糖酸冼必泰修飾載體的傅立葉紅外圖譜 采用傅立葉紅外波譜儀對葡萄糖酸冼必泰修飾的親和載體與空白樹脂的結構進行了表征，結果如圖4 所示。

圖4 親和載體和空白載體的紅外圖譜Fig.4 Infrared spectrogram of affinity resin carrier and resin carrier

由圖4 可見，在空白載體紅外圖譜中的1 711 cm-1處出現(xiàn)了羧酸C=O 的伸縮振動峰，當載體修飾上葡萄糖酸冼必泰后，其峰消失，說明載體中的羧基與葡萄糖酸冼必泰之間發(fā)生了酰胺化交聯(lián)反應。此外，在親和載體紅外圖譜中的1 633 cm-1處出現(xiàn)了酰胺II 帶的N-H 變形振動峰，3 292 cm-1處出現(xiàn)了仲胺反對稱伸縮振動峰，同時在親和載體紅外圖譜中的2 941 cm-1處出現(xiàn)了較強的-CH2振動峰，說明親和樹脂上引入了氨基和甲基，即葡萄糖酸冼必泰已修飾在載體上。

2.3 枯草芽孢桿菌中性蛋白酶在親和載體上的固定

2.3.1 加酶量對枯草芽孢桿菌中性蛋白酶固定化效果的影響 在EDC 添加量為137 mg，NHS 添加量為49.3 mg 的條件下，考察不同加酶量（75、150、300、600、900、1 200、1 500 U）對固定化酶活力的影響。結果如圖5 所示。可知，隨著枯草芽孢桿菌中性蛋白酶添加量的增加，固定化酶的活力呈先增加后略微減小的趨勢，這是由于當載體的載酶量達到一定程度后，再增加給酶量反而會增加固定化酶分子之間的擁擠程度，使之與底物結合時的空間位阻增大，造成固定化酶活力的降低。當枯草芽孢桿菌中性蛋白酶的添加量為600 U 時，固定化酶酶活力最大，達到380 U/g 數(shù)脂，因此選擇600 U 作為最適的酶添加量。

圖5 酶添加量對固定化效果的影響Fig.5 Effects of enzyme concentration on the activity of immobilizated neutral protease

2.3.2 EDC 添加量對枯草芽孢桿菌中性蛋白酶固定化效果的影響 在加酶量為600 U（15 mL 400 μg/mL ），NHS 添加量為49.3 mg 的條件下，考察不同EDC 添加量（3.4，6.8，13.7，27.4，54.8，137 mg）對固定化酶活力的影響。結果如圖6 所示。

由圖6 可知，隨著EDC 添加量的增加，固定化酶酶活力呈先增加后略微減小的趨勢。當EDC 添加量達到13.7 mg 時，固定化酶的活力達到最大，為398 U/g。這是由于當EDC 添加量達到一定程度后，再增加EDC 的量反而會抑制枯草芽孢桿菌中性蛋白酶的活力，導致固定化酶活力降低。因此選取EDC 添加量為13.7 mg 為最佳水平。

圖6 E DC 添加量對固定化效果的影響Fig.6 Effects of EDC concentration on the activity of immobilizated neutral protease

2.4 枯草芽孢桿菌中心蛋白酶的傅立葉紅外分析

通過傅立葉紅外光譜儀測定固定化酶、游離酶及修飾配基的親和樹脂載體的傅立葉紅外圖譜，結果如圖7 所示。

圖7 固定化酶、游離酶和親和載體的傅立葉紅外圖譜Fig.7 Infrared spectrogram of oriented immobilized neutral protease，free neutral protease and affinity carrier

由圖7 可見，固定化酶、游離酶及親和載體的紅外圖譜在3 290 cm-1處都有N-H 的伸縮振動吸收峰，說明三者都含有氨基。其中親和載體N-H 伸縮振動峰最強，表明親和載體上具有最多的氨基，但隨著親和載體的氨基與枯草芽孢桿菌中性蛋白酶的羧基之間酰胺化反應的進行，親和載體上所含氨基減少。固定化酶及親和載體的紅外圖譜在1 633 cm-1處有酰胺II 帶（N-H 變形振動峰），且固定化酶在此處的振動頻率更強，而游離酶紅外圖譜在此沒有振動峰，說明酶分子與親和載體之間發(fā)生酰胺化交聯(lián)反應。固定化酶及親和載體在紅外圖譜1 547 cm-1處都有仲酰胺II 帶（N-H 的彎曲振動）峰，且振動頻率不同，而游離酶無此振動峰，說明枯草芽孢桿菌中性蛋白酶與修飾小分子配基的親和載體發(fā)生反應[19]。

2.5 固定化酶及游離酶的米氏常數(shù)

Km值是酶的特征常數(shù)，可以用來表示酶的專一性以及與底物的親和性，因而本研究根據(jù)米氏方程，采用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法測定了固定化酶、游離酶及隨意固定化酶的米氏常數(shù)。結果表明，固定化酶、游離酶及隨意固定化酶的Km值分別為2.9、1.7、7.1 mg/mL。根據(jù)文獻，以傳統(tǒng)方法制備的固定化酶的Km值通常會增加1.3～4.3 倍[20-22]。在本研究中，Km值僅增加了1.70 倍，表明該固定化方法對中性蛋白酶的構象和活性位點幾乎沒有影響，酶對底物蛋白具有較高的親和力。而隨意固定化酶的Km值為7.1，比游離酶高約4.18 倍。隨意固定化酶與底物親和力的降低可能是由于酶構象發(fā)生了變化，活性位點形成的空間位阻對溶質分子的轉運產生了阻力。

3 結語

采用酰胺化偶聯(lián)方法將葡萄糖酸冼必泰修飾到弱酸性陽離子載體上，再將枯草芽孢桿菌中性蛋白酶交聯(lián)在親和載體上以制備固定化酶。以固定化酶活力為指標，確定了固定化枯草芽孢桿菌中性蛋白酶的最佳制備工藝：葡萄糖酸冼必泰添加量為0.095 mmol/L，載體羧基：EDC（摩爾比）為1∶3，載體活化時間為1 h，枯草芽孢桿菌中性蛋白酶添加量為600 U，酶活化EDC 添加量13.7 mg。傅立葉紅外光譜結果表明，枯草芽孢桿菌中性蛋白酶已經成功偶聯(lián)到葡萄糖酸冼必泰修飾的親和載體上。采用該法制備的固定化酶的Km值為2.9 mg/mL，表明其與底物具有較高的親和力。