李 勛，周楠迪，田亞平

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

抗生素是全球最廣泛使用的抗菌藥物，但其在醫(yī)藥與畜牧方面的過度使用造成嚴(yán)重后果，耐抗生素細(xì)菌的出現(xiàn)，使得抗生素的使用面臨嚴(yán)重挑戰(zhàn)[1-2]，因此，尋找可代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素藥物且對(duì)人體與環(huán)境無毒害、無殘留的天然抑菌物質(zhì)成為研究熱點(diǎn)，細(xì)菌素獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，使其成為抗生素類藥物替代品的首要選擇，在生物飼料添加劑、微生態(tài)制劑[3]、生物藥品等領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景[4]。細(xì)菌素是由某些細(xì)菌代謝過程中通過核糖體合成的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白復(fù)合物[5]。芽孢桿菌（Bacillus）在自然界中分布廣泛，生理特性豐富，能夠產(chǎn)生酶類、胞外桿菌肽、大環(huán)內(nèi)酯、類噬菌體顆粒等多種拮抗物質(zhì)[5-6]。

地衣芽孢桿菌能夠代謝產(chǎn)生多種物質(zhì)，在工業(yè)和醫(yī)藥業(yè)中應(yīng)用較多，是一種具有極高應(yīng)用價(jià)值的微生物[7]。地衣芽孢桿菌產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)種類較多，其中，抗菌肽因其可作為抗生素的替代品，受到重視。Mendo 等[8]報(bào)道地衣芽孢桿菌189 可產(chǎn)生抑菌多肽，可以抑制革蘭氏陽性菌株的生長(zhǎng)。樊陳[1]等從地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中分離出一種具有廣譜抑菌效果的抗菌肽，該抑菌肽對(duì)革蘭氏陽性菌株抑制效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌株。紀(jì)兆林等[9]對(duì)地衣芽孢桿菌培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，抑菌率提升了34.6%，并從發(fā)酵液中分離出一種穩(wěn)定性高的抑菌肽。

本研究從實(shí)驗(yàn)室保藏菌株中篩選出一株高抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌，對(duì)其菌落形態(tài)、生理生化特征與16S rRNA 基因水平鑒定。通過單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)，確定其最適發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件。使用硫酸銨分級(jí)鹽析與離子交換層析對(duì)發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)進(jìn)行分離，并對(duì)分離純化所得抑菌物質(zhì)的特性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 實(shí)驗(yàn)室保藏菌株JN-814B、JN-814C、JN-814D、JN-814E、JN-814、JN-814G、JN-814LX、凝結(jié)芽孢桿菌ACCC10229、凝結(jié)芽孢桿菌CICC21736、凝結(jié)芽孢桿菌0076（T）。

1.1.2 指示菌株 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginose）、大腸桿菌（E.coli）、酵母菌（Yeast）、黑曲霉（Aspergillus niger）。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基；YPD 培養(yǎng)基；PDA 培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基向其中添加1.5%～2%瓊脂粉。

初始培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性物質(zhì)的檢測(cè) 采用管碟法[10]檢測(cè)抑菌活性物質(zhì)。

1.2.2 目的菌株的選育 將實(shí)驗(yàn)室保藏菌株分別活化后，接種入LB 培養(yǎng)基，適宜條件下培養(yǎng)12 h，發(fā)酵液10 000 r/min，4 ℃離心20 min，以金黃色葡萄球菌為指示菌，以管碟法測(cè)定上清液對(duì)其的抑制作用，選擇抑菌效果最佳的菌株作為目標(biāo)菌株。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 采用單因素實(shí)驗(yàn)，將初始培養(yǎng)基中碳源葡萄糖分別替換為蔗糖、乳糖、麥芽糖、環(huán)糊精、玉米淀粉，將其中氮源物質(zhì)胰蛋白胨替換為魚粉蛋白胨，豆餅、豆粕、硫酸銨、尿素，將其中無機(jī)鹽分別替換為氯化鉀，磷酸氫二鉀，磷酸氫二鈉，硫酸鎂。分別對(duì)單因素優(yōu)化出的3 個(gè)營養(yǎng)元素與酵母粉進(jìn)行添加量?jī)?yōu)化。根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，設(shè)置3個(gè)水平對(duì)其進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。

1.2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化 使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，在其他條件不變的情況下，分別對(duì)發(fā)酵初始pH，裝液量，發(fā)酵溫度，接種量，發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.5 優(yōu)化結(jié)果的驗(yàn)證 為驗(yàn)證培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果的可靠性，對(duì)優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成與培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證，分別以優(yōu)化前與優(yōu)化后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測(cè)發(fā)酵液上清液的抑菌效果。

1.2.6 抑菌效價(jià)的計(jì)算 抑菌效價(jià)計(jì)算采用管碟法：二劑量法[11]。

1.3 抑菌活性物質(zhì)的分離純化

1.3.1 硫酸銨分級(jí)鹽析[12]將發(fā)酵液離心，取上清液，分別向其中添加硫酸銨至飽和度為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，離心，取沉淀，將沉淀溶于50 mmol/L，pH 6.8 的Tris-HCl 緩沖液中，將溶解液置于緩沖液中透析除鹽[13]，檢測(cè)透析液的抑菌活性[14]。

1.3.2 DEAE-Sephrose-FF 陰離子交換層析 硫酸銨沉淀后的溶解液，DEAE-Sephrose-FF 陰離子交換層析柱經(jīng)0.05 mmol/L，pH 6.8 的Tris-HCl 緩沖液平衡后，上樣量1 mL，使用0%、27%、46%、100%1 mol/L NaCl Tris-HCl 緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，收集各峰組分并濃縮，檢測(cè)其抑菌活性[15]。

1.4 抑菌肽的特性研究

1.4.1 抑菌肽蛋白酶敏感性 取陰離子交換分離后的抑菌活性物質(zhì)樣品，分別置于6 支試管中，調(diào)節(jié)pH 至所用蛋白酶最適pH，分別加入酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、亮氨酸氨肽酶，脯氨酸氨肽酶，使酶的最終濃度為10 mg/mL，對(duì)照組添加無菌水，在各酶最適溫度水浴30 min 后調(diào)pH 至中性。檢測(cè)各組樣品抑菌活性。

1.4.2 抑菌肽氨基酸組成分析 對(duì)離子交換后所得抑菌肽進(jìn)行濃鹽酸水解，高效液相色譜檢測(cè)水解后樣品中的氨基酸組成，與未經(jīng)水解的樣品進(jìn)行對(duì)比，獲得目標(biāo)抑菌肽的氨基酸組成。

1.4.3 抑菌肽溫度穩(wěn)定性 取陰離子交換分離后的抑菌活性肽樣品，配置成0.02 g/mL 溶液，放入離心管中，分別置于50，60，70，80，90，100 ℃條件下水浴20 min，冷卻至室溫后測(cè)定抑菌活性。

1.4.4 抑菌肽pH 穩(wěn)定性 取7 管陰離子交換分離后的抑菌活性肽樣品，使用0.05 mol/L 的NaOH 溶液與0.05 mol/L HCl 分別調(diào)整pH 4～10，37 ℃處理12 h，調(diào)整pH 至7.0 后測(cè)定其抑菌活性

1.4.5 抑菌肽抑菌譜 將硫酸銨初步分離得到的抑菌肽分別對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、酵母等菌株做抑菌活性檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的選育

2.1.1 目的菌株的選擇 將實(shí)驗(yàn)室保藏的10 株菌發(fā)酵液上清液抑菌效果如圖1 所示。其中，菌株JN-814C 抑菌圈直徑最大，對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果最明顯，故選擇菌株JN-814C 為抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌進(jìn)行研究。

2.1.2 菌株JN-814C 的鑒定 菌株JN-814C 在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落為淺黃色圓形菌落，不透明，表面光滑，菌落邊緣呈不規(guī)則狀。其生理生化特征見表1。

對(duì)菌株JN-814C 進(jìn)行16S rRNA 測(cè)序，將所測(cè)得的序列與Genbank 中的16S rRNA 相似性進(jìn)行比較。菌株JN-814C 與Bacillus chenifoormis 的16S rRNA 序列同源性達(dá)到99%以上。

綜合生理生化鑒定和16S rRNA 測(cè)序結(jié)果，可以認(rèn)為菌株JN-814C 為地衣芽孢桿菌（Bacillus cheniformis）的一個(gè)亞種。

圖1 實(shí)驗(yàn)室保藏菌株發(fā)酵液上清液抑菌效果Fig.1 Antibacterial results of differernt bacterial strains preserved in the laboratory

2.2 菌株JN-814C 產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的優(yōu)化

2.2.1 菌株JN-814C 細(xì)胞生長(zhǎng)與發(fā)酵曲線 由圖2 可知，菌株JN-814C 接種入發(fā)酵培養(yǎng)基后即開始產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，在22 h 時(shí)分泌產(chǎn)物抑菌圈直徑達(dá)到最大值，抑菌凈直徑約為23 mm，發(fā)酵30 h 以后，由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)被消耗，不利于代謝產(chǎn)物積累，發(fā)酵液中活菌數(shù)量也逐漸減少，同時(shí)，產(chǎn)物抑菌圈直徑開始逐漸下降，發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)的量開始減少。因此推斷抑菌活性物質(zhì)主要產(chǎn)生于菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，在發(fā)酵后期抑菌活性物質(zhì)的減少可能與菌體分泌蛋白酶有關(guān)。故選擇22 h 作為發(fā)酵培養(yǎng)周期。

圖2 菌株JN-814C 產(chǎn)抗菌物質(zhì)的發(fā)酵曲線Fig.2 Fermentation curve of strain JN-814C for an antibacterial substance productionan antibacterial substance production

2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的確定 由圖3 可知，培養(yǎng)基最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽分別為糊精、胰蛋白胨、硫酸鎂。其最適添加量分別為糊精0.5%，胰蛋白胨0.5%，硫酸鎂0.1%。培養(yǎng)基成分正交優(yōu)化結(jié)果見表2。

經(jīng)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)，確定培養(yǎng)基中各因素影響大小依次為A＞C＞B＞D，最優(yōu)培養(yǎng)及配方為糊精5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L，硫酸鎂3 g/L。

2.2.3 培養(yǎng)條件的確定 培養(yǎng)條件產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌活性的影響見圖4。

1）種子培養(yǎng)時(shí)間的確定。由圖4（a）可以看出，種子培養(yǎng)時(shí)間最佳為22 h，此時(shí)菌體生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)末期，菌體生長(zhǎng)速率與菌體數(shù)量均處在較高水平，故選擇種齡為22 h。

2）培養(yǎng)溫度對(duì)抑菌效果的影響。使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，分別在25、28、31、34、37、40、43 ℃溫度條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測(cè)發(fā)酵液上清液抑菌效果。由圖4（b）可知，溫度對(duì)發(fā)酵上清液抑菌效果影響較大，低溫和高溫都不利于抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生，在37 ℃時(shí)，分泌產(chǎn)物抑菌圈直徑大到最大，所以選擇37 ℃作為發(fā)酵的培養(yǎng)溫度。

3）初始pH 對(duì)抑菌效果的影響。將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH分別調(diào)整為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，培養(yǎng)22 h 后檢測(cè)發(fā)酵上清液的抑菌效果。由圖4（c）可知，在pH 范圍為6.0～9.0 內(nèi)，培養(yǎng)基初始pH對(duì)發(fā)酵液抑菌效果基本無影響。

4）裝液量對(duì)抑菌效果的影響。分別向250 mL錐形瓶中添加20、30、40、50、60、70、80 mL 培養(yǎng)基，培養(yǎng)后測(cè)定發(fā)酵上清液的抑菌效果。由圖4（d）可知，裝液量在50 mL 以內(nèi)時(shí)，隨著裝液量增加，上清液抑菌圈直徑逐漸增大，裝液量超過50 mL 以后，上清液抑菌圈直徑迅速下降，在裝液量50 mL 時(shí)分泌產(chǎn)物抑菌圈直徑最大，抑菌效果最佳，故選擇50 mL 作為發(fā)酵過程裝液體積。

圖3 培養(yǎng)基成分對(duì)產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌活性的影響Fig.3 Effects of carbon source on antibacterial activity

表2 培養(yǎng)基成分正交優(yōu)化結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of medium composition

圖4 培養(yǎng)條件產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌活性的影響Fig.4 Effects of fermentation conditions on antibacterial activity

5）接種量對(duì)抑菌效果的影響。由圖4（e）可以看出，接種量在1%～10%范圍內(nèi)時(shí)，接種量大小對(duì)發(fā)酵液抑菌效果影響較大，接種量在2%時(shí)，抑菌圈最大，發(fā)酵液的抑菌效果最佳，隨著接種量增大，上清液抑菌圈直徑呈減小趨勢(shì)。

6）優(yōu)化結(jié)果的驗(yàn)證。為驗(yàn)證培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果的可靠性，對(duì)優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成與培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證，分別對(duì)優(yōu)化前與優(yōu)化后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測(cè)發(fā)酵液上清液的抑菌效果。結(jié)果如圖5 所示。

優(yōu)化后發(fā)酵液上清液抑菌效果得到提高，通過計(jì)算，優(yōu)化后發(fā)酵液抑菌效果較未優(yōu)化的發(fā)酵液抑菌效果提高41.4%。

圖5 不同發(fā)酵條件下的抑菌效果Fig.5 Bacteriostatic effects of different fermentation conditions

2.3 抑菌活性物質(zhì)的分離純化

2.3.1 硫酸銨沉淀粗提取 硫酸銨鹽析如圖6 所示。由圖6 可知，菌株JN-814C 的發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨分級(jí)鹽析濃縮后，抑菌活性物質(zhì)主要集中在硫酸銨飽和度為40%～70%的范圍之內(nèi)，在70%～80%范圍內(nèi)抑菌活性物質(zhì)的量減少，說明該菌株所產(chǎn)抑菌性物質(zhì)可被硫酸銨沉淀，具有蛋白性質(zhì)，為保證抑菌活性物質(zhì)的收率，選擇硫酸銨飽和度40%～80%作為上清液處理濃度。

圖6 硫酸銨鹽析Fig.6 Ammonium sulfate salting-out

2.3.2 DEAE-Sepharose-FF 陰離子交換層析分離選用DEAE-Sepharose-FF 對(duì)硫酸銨粗提液進(jìn)行分離，收集陰離子交換層析洗脫的個(gè)各峰組分，富集濃縮后測(cè)定其抑菌能力，結(jié)果抑菌性物質(zhì)分布于峰a 與峰b，其中，a 峰為穿透峰，峰b 為27%NaCl 洗脫峰，分別收集峰a 與峰b，冷凍干燥得到純化的抑菌肽。

圖7 DEAE-Sepharose-FF 離子交換圖譜Fig.7 DEAE-Sepharose-FF anion exchange chromatogram

圖8 層析出峰的各峰抑菌效果Fig.8 Bacteriostatic spectrum of the three fractions

2.4 抑菌物質(zhì)的特性研究

發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)經(jīng)硫酸銨沉淀與DEAE陰離子交換層析后得到分離，表現(xiàn)出一定的蛋白性，對(duì)其進(jìn)行蛋白酶處理。

2.4.1 蛋白酶敏感性 蛋白酶對(duì)抑菌活性的影響如圖9 所示。由圖9 可知，純化后的抑菌活性物質(zhì)經(jīng)7 種蛋白酶處理后，堿性蛋白酶對(duì)其抑菌活性影響較大，其次為亮氨酸氨肽酶，結(jié)果表明該抑菌物質(zhì)是多肽類物質(zhì)，其肽鏈N 端存在亮氨酸殘基。

圖9 蛋白酶對(duì)抑菌活性的影響Fig.9 Effects of proteases on antimicrobial activity

表3 抑菌肽的抑菌譜Table 3 Antibacterial spectrum of antimicrobial peptide

2.4.2 抑菌肽氨基酸組成 抑菌肽氨基酸的組成如表4 所示。氨基酸分析表明，分離出的抑菌肽主要含有9 種氨基酸，其中谷氨酸的含量處于較高水平。

表4 抑菌肽氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of antimicrobial peptide

2.4.3 熱穩(wěn)定性 溫度對(duì)抑菌活性的影響如圖10所示。由圖10 可知，純化后的抑菌肽經(jīng)不同溫度處理，在80 ℃以內(nèi)時(shí)，抑菌效果保持在較高水平，且相對(duì)穩(wěn)定，超過80 ℃以后，抑菌效果明顯下降，說明該菌株所產(chǎn)抑菌肽具有一定的溫度耐受性，但對(duì)80 ℃以上高溫耐受性較差。

圖10 溫度對(duì)抑菌活性的影響Fig.10 Effects of temperature on antimicrobial activity

2.4.4 pH 穩(wěn)定性 將純化后抑菌肽樣品在不同pH條件下處理后，抑菌性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11 所示，從圖11 可以看出抑菌圈直徑變化較小，說明在pH 4～10范圍內(nèi)，該細(xì)菌素活性較為穩(wěn)定。

圖11 p H 對(duì)抑菌活性的影響Fig.11 Effects of pH on antimicrobial activity

2.4.5 抑菌肽抑菌譜的測(cè)定 抑菌肽的抑菌譜如表3 所示。結(jié)果表明，分離所得抑菌肽對(duì)革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出很好的拮抗性，對(duì)革蘭氏陰性菌及真菌無抑制作用。

3 結(jié)語

本研究篩選出一株產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)較高的菌株，地衣芽孢桿菌JN-814C，通過發(fā)酵優(yōu)化，將其抑菌效價(jià)提高41.4%，對(duì)發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化后，通過蛋白酶處理與氨基酸分析確定其為一種抑菌肽，研究表明，該抑菌肽穩(wěn)定性較好，其對(duì)革蘭氏陽性菌有較好的抑制作用，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。