孫海燁，張 梁*，2，李由然，顧正華，丁重陽(yáng)，2，石貴陽(yáng)，2

（1.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）能以乳酸為唯一碳源和能源，具有營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)速率快、分泌蛋白能力強(qiáng)、不會(huì)對(duì)蛋白高度糖基化、不產(chǎn)生內(nèi)毒素等優(yōu)點(diǎn)[1]，作為美國(guó)FDA（Food and Drug Administration）認(rèn)定的食品安全級(jí)酵母菌，到目前為止，已有上百種蛋白在該酵母中成功表達(dá)并實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，涉及食品、生物和醫(yī)藥等領(lǐng)域[2]。K.lactis外源基因表達(dá)的載體主要包括游離型和整合型兩類，前者如pKD1、pKRAS，拷貝數(shù)高但在無(wú)選擇壓力條件下易丟失，后者主要為當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的載體pKLAC1，穩(wěn)定性高，但拷貝數(shù)相對(duì)較低且只能滿足單個(gè)基因的整合表達(dá)[3-4]。此外，K.lactis 在外源蛋白分泌表達(dá)中仍存在瓶頸，其蛋白產(chǎn)量還有很大的提升空間。隨著生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用，酵母表達(dá)系統(tǒng)得到相應(yīng)的發(fā)展，Dujon 等于2004 年完成K.lactis 的全基因組測(cè)序[5]，有利于深入掌握該菌株的遺傳信息并進(jìn)行合理改造。研究者主要通過(guò)增加外源基因的劑量或共表達(dá)分泌途徑中的輔助因子、分子伴侶等方式來(lái)提高外源蛋白的產(chǎn)量，而目前表達(dá)載體的選擇較為局限，因此亟待構(gòu)建合適的分子工具滿足工業(yè)化的不同需求。

核糖體DNA（rDNA）是細(xì)胞核中編碼核糖體RNA（rRNA）的脫氧核苷酸序列，由轉(zhuǎn)錄區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)組成，具有高度保守性，以重復(fù)單元存在于真核生物基因組中[6]。以rDNA 為同源重組位點(diǎn)構(gòu)建表達(dá)載體，在無(wú)選擇壓力條件下可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)目的基因多拷貝或多個(gè)目的基因單拷貝穩(wěn)定整合于基因組中[7-8]，通過(guò)增加外源基因拷貝數(shù)或共表達(dá)輔助因子從而實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效分泌表達(dá)的目的[9]，且對(duì)宿主菌無(wú)不良影響[10]，該策略已成功應(yīng)用于釀酒酵母（Sacchormyces cerevisiae）[11-12]、畢赤酵母（Pichia pastoris）[9]、K.lactis[13-15]、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）[16]、多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha）[17-18]、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）[19]、法夫酵母（Phaffia rhodozyma）[20]、Arxula adeninivorans[21-22]和產(chǎn)甘油假絲酵母（Candida glycerinogenes）[23]等酵母菌的異源表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，整合位點(diǎn)在rDNA 單元中的位置、性質(zhì)，表達(dá)盒的大小以及篩選標(biāo)記的選擇對(duì)整合效率和穩(wěn)定性產(chǎn)生影響[6，11，14，18-19]，從單拷貝到多達(dá)數(shù)十個(gè)拷貝均有報(bào)道，表明整合位點(diǎn)的選擇導(dǎo)致宿主菌種基因拷貝數(shù)的差異。K.lactis 基因組中rDNA 有68 個(gè)重復(fù)單元，每個(gè)單元長(zhǎng)度為8.6 kb 左右，由5S、26S、18S、基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列（ITS）和外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ETS）組成[14，24]。目前，在K.lactis 中利用rDNA 介導(dǎo)同源重組尚處于初步階段，研究發(fā)現(xiàn)因選取rDNA 單元中不同位置的同源整合序列，重組菌的整合拷貝數(shù)有很大差異，少則幾個(gè)，多則達(dá)到120 個(gè)[13-15]?，F(xiàn)階段，對(duì)于rDNA 重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)、重要元件的作用以及分子重組機(jī)制等缺乏系統(tǒng)認(rèn)識(shí)，需要進(jìn)一步深入研究。

腺苷酸脫氨酶（AMP deaminase，EC 3.5.4.6）是一種氨基水解酶，催化腺苷酸脫去氨基產(chǎn)生肌苷酸和NH3，在嘌呤代謝循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用，維持機(jī)體免疫力和腺苷酸能荷，作為工業(yè)生產(chǎn)中重要的酶已廣泛用于食品、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[25]?；谠撁阜€(wěn)定性高、易于定量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，以AMPD 為報(bào)告基因，并以實(shí)驗(yàn)室前期研究中的強(qiáng)啟動(dòng)子pScGAL7 為外源基因表達(dá)的調(diào)控元件，構(gòu)建18S rDNA 介導(dǎo)的整合型表達(dá)載體pTRGA-amdS，利用RT-QPCR 測(cè)定重組菌外源基因的整合拷貝數(shù)[26]，初步探究拷貝數(shù)與AMP 脫氨酶酶活的關(guān)系，并測(cè)定重組載體的穩(wěn)定性，為進(jìn)一步研究rDNA 單元在K.lactis 基因工程中的應(yīng)用作了初步嘗試，對(duì)具有廣闊應(yīng)用前景的K.lactis 進(jìn)一步分子改造奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 文中所用質(zhì)粒和菌株見(jiàn)表1。

表1 本研究中所使用的質(zhì)粒和菌株Table 1 Plasmids and strains used in this study

1.1.2 引物 根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)PCR 特異性引物（表2），委托金唯智公司合成。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，固體培養(yǎng)基添加20 g/L 瓊脂粉，添加終濃度為100 μg/mL 的氨芐青霉素用于E.coli轉(zhuǎn)化子的篩選；YEPD 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨20.0，酵母粉10.0，葡萄糖20.0，用于K.lactis、S.cerevisiae的培養(yǎng)；YEPDG 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨20.0，酵母粉10.0，葡萄糖10.0，半乳糖10.0；YEPG 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨20.0，酵母粉10.0，半乳糖20.0；YCB 固體培養(yǎng)基（g/L）[26]：酵母基礎(chǔ)碳源11.7，1 mol/L pH 7.0 的KH2PO4-K2HPO4緩沖液30 mL/L（終濃度30 mmol/L），瓊脂粉20，滅菌后加入0.5 mol/L 的乙酰胺10 mL/L（終濃度5 mmol/L），用于K.lactis 重組菌的篩選。

1.1.4 工具酶、主要試劑及儀器 限制性內(nèi)切酶Kpn I、Xho I、Sal I、Hind III、Bgl II，美國(guó)Fermentas公司；SYBR Premix Ex TaqTMII、CIAP、T4 DNA 連接酶，大連Takara 公司；質(zhì)粒小量提取、DNA 片段的純化、回收試劑盒，pfu、taq 等DNA 聚合酶，杭州寶賽生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素（Amp），上海生工生物工程股份有限公司；酵母基礎(chǔ)碳源（yeast carbon base，YCB），New England Biolabs 公 司；5’-腺苷酸，美國(guó)Sigma 公司。Multiporator 電轉(zhuǎn)儀，德國(guó)Eppendorf 公司；Bio-Rad S1000 PCR 儀、Chemi Doc凝膠成像儀、CFX96 熒光定量PCR 儀，美國(guó)Bio-Rad公司；紫外分光光度計(jì)，美國(guó)UNICO 公司。

1.1.5 溶液配制 原始底物：取1 mL 0.08 mol/L NaHCO3溶液溶解13.9 mg 5’-腺苷酸。反應(yīng)底物：原始底物用pH 6.0 的0.1 mol/L 琥珀酸鈉-NaOH 溶液稀釋400 倍至終濃度為0.1×10-3mol/L。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆及質(zhì)粒的構(gòu)建 以質(zhì)粒pT-AMPD為模板，擴(kuò)增鼠灰鏈霉菌（Streptomyces murinus）來(lái)源并經(jīng)密碼子優(yōu)化的AMPD 基因，Xho I 和Sal I 雙酶切該片段，連接至經(jīng)同樣雙酶切的載體pKLAC1，構(gòu)建質(zhì)粒pKLAC1-AMPD。以該質(zhì)粒為模板，分別利 用pLAC4-AMPD-F/R、amdS-F/R 引 物，擴(kuò) 增pLAC4-αMF-AMPD-tLAC4 片段和pADH2-amdSTT 片段，與質(zhì)粒pMD 19T-simple 連接，構(gòu)建質(zhì)粒pTLA 和pT-amdS。

用酸性玻璃珠法提取酵母染色體基因組，以S.cerevisiae W303-1A 基因組為模板，pScGAL7-F/R為引物，擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為301 bp 的pScGAL7 片段，Kpn I 和Hind III 雙酶切連接至同樣酶切的質(zhì)粒pTLA，替換pLAC4，構(gòu)建質(zhì)粒pTGA。質(zhì)粒pT-amdS經(jīng)Bgl II 酶切后膠回收目的片段（2 527 bp）后連接至Bgl II 單酶切并經(jīng)CIAP 去磷酸化的線性化質(zhì)粒pTGA，經(jīng)Dir1-F/R 引物驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pTGA-amdS。

以K.lactis GG799 基因組為模板，分別以18S rDNA-3’-F/R 和18S rDNA-5’-F/R 為引物，擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為1 199 bp 的18S rDNA-3’ 片段和562 bp的18S rDNA-5’片段，采用重疊延伸PCR 擴(kuò)增得到18S rDNA-3’-18S rDNA-5’融合片段，與質(zhì)粒pMD 19T-simple 連接，構(gòu)建質(zhì)粒pTR。

質(zhì)粒pTGA-amdS 經(jīng)Kpn I 酶切后膠回收目的片段（5 282 bp）后連接至Kpn I 單酶切并經(jīng)CIAP去磷酸化的線性化質(zhì)粒pTR，經(jīng)Dir2-F/R 引物驗(yàn)證正確的重組表達(dá)載體命名為pTRGA-amdS。

1.2.2 重組載體電轉(zhuǎn)化K.lactis GG799 Sac II 線性化重組表達(dá)載體pTRGA-amdS 后電轉(zhuǎn)化K.lactis GG799，涂布YCB 平板，于30 ℃培養(yǎng)3～4 d，挑取單菌落提取染色體基因組，利用Int-F/R 引物進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，正確整合的重組菌可以擴(kuò)增得到大小為2 032 bp 的片段。

1.2.3 內(nèi)參基因GAPDH 的克隆及標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建以K.lactis/pTRGA-amdS 染色體為模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中K.lactis 三磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）序列（GenBank 登錄號(hào)X52871）設(shè)計(jì)特異性引物GAPDH-F/R，擴(kuò)增得到941 bp 的片段，連接至質(zhì)粒pMD 19-T simple，轉(zhuǎn)化E.coli JM109 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，委托上海生工公司測(cè)序，得到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pT-GAPDH。AMPD 基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為pT-AMPD。

1.2.4 GAPDH 基因和AMPD 基因RT-QPCR 反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線 以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pT-GAPDH 和pT-AMPD為標(biāo)準(zhǔn)品，用微量核酸定量?jī)x測(cè)定濃度后相應(yīng)的分子數(shù)（拷貝數(shù)）為

式中：m 為DNA 質(zhì)量，g；L 為DNA 長(zhǎng)度，bp。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品每微升質(zhì)粒溶液所含的拷貝數(shù)，對(duì)其進(jìn)行10 倍梯度稀釋后用作RT-QPCR 反應(yīng)的模板，其中pT-GAPDH 標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至103、104、105、106、107個(gè)拷貝/μL 的樣品，pT-AMPD 標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至102、103、104、105、106個(gè)拷貝/μL的樣品。根據(jù)GAPDH 和AMPD 基因序列，分別設(shè)計(jì)RTQPCR 反應(yīng)引物RT-GAPDH-F/R 和RT-AMPD-F/R，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為144，142 bp。反應(yīng)體系（10 μL）：SYBR Premix ExTaqTMII PCR buffer 5 μL，模板0.5 μL，上下游引物各0.3 μL，滅菌的dd H2O 3.9 μL；擴(kuò)增條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)平行反應(yīng)。以起始模板中質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，不同濃度梯度下的Ct 值為縱坐標(biāo)，建立GAPDH 和AMPD 標(biāo)準(zhǔn)曲線。RTQPCR 的擴(kuò)增效率為

式中：S 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.2.5 AMPD 基因拷貝數(shù)的檢測(cè) 提取重組菌染色體基因組并稀釋至40～60 ng/μL 后作為模板，與上述測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的RT-QPCR 反應(yīng)同步進(jìn)行，得到重組菌基因組中GAPDH 和AMPD 基因的Ct 值，分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到基因的初始拷貝數(shù)，因K.lactis GG799 為單倍體菌株，且GAPDH 在基因組中為單拷貝，AMPD 基因的拷貝數(shù)為

式中：CopyA為目的基因起始模板拷貝數(shù)；CopyG為GAPDH 基因起始模板拷貝數(shù)。

1.2.6 重組菌AMP 脫氨酶酶活測(cè)定 AMP 脫氨酶酶活定義：在pH 6.0，60 ℃條件下，反應(yīng)液于波長(zhǎng)265 nm 處吸光值每分鐘改變0.001 為酶的一個(gè)活力單位。

其中：△A265為試驗(yàn)組與對(duì)照組在265 nm 處吸光值的差值；K 為待測(cè)酶液的稀釋倍數(shù)；T 為反應(yīng)時(shí)間，min。

AMP 脫氨酶的酶活參照文獻(xiàn)[25]的方法采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)：在試管中加入3 mL 反應(yīng)底物后置于60 ℃水浴鍋中保溫5 min，加入100 μL 稀釋適當(dāng)倍數(shù)的待測(cè)酶液并充分混勻，立即計(jì)時(shí)，反應(yīng)15 min，加入3 mL 10%（v/v）高氯酸溶液終止反應(yīng)。對(duì)照試驗(yàn)方法同上，反應(yīng)底物60 ℃保溫后冰水預(yù)冷，加3 mL 10%（v/v）的高氯酸后再加100 μL 待測(cè)酶液混勻。紫外分光光度計(jì)于265 nm 處，用光程10 mm 的石英比色皿測(cè)定吸光值（以去離子水校零）。

YEPD 平板活化重組菌，挑取單菌落接種于YEPD 培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min 培養(yǎng)36 h 后轉(zhuǎn)接至50 mL YEPD 培養(yǎng)基，使菌體初始OD600在0.5 左右，30 ℃，200 r/min 搖瓶培養(yǎng)120 h，測(cè)定發(fā)酵上清液AMP 脫氨酶酶活，設(shè)置3 個(gè)平行。

1.2.7 重組菌株質(zhì)粒穩(wěn)定性測(cè)定 YEPD 平板活化重組菌，挑取單菌落接種于20 mL YCB 培養(yǎng)基（100 mL 搖瓶裝液量為20 mL），30 ℃，200 r/min 培養(yǎng)16 h，轉(zhuǎn)接至20 mL 新鮮的YEPD 培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min 培養(yǎng)12 h，測(cè)定菌液OD600，記為N，轉(zhuǎn)接至新鮮YEPD 培養(yǎng)基中，并控制菌體初始OD600在0.1 左右，每隔12 h 重復(fù)此操作，共轉(zhuǎn)接10 次至酵母總繁殖時(shí)間為120 h，取適量菌體用無(wú)菌水稀釋后分別涂布YCB 及YEPD 平板，30 ℃培養(yǎng)3 d，計(jì)相應(yīng)平板上的菌落數(shù)，分別記為A1和A2。酵母繁殖世代及質(zhì)粒穩(wěn)定性計(jì)算公式如下

式中：n 為繁殖世代；N：菌液OD600值；A1為YCB 平板菌落數(shù)；A2為YEPD 平板菌落數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體pTRGA-amdS 的構(gòu)建

以質(zhì)粒pT-AMPD 為模板PCR 擴(kuò)增得到AMPD 片段大小為1 476 bp，凝膠電泳顯示在1.1～1.7 kb 有單一核酸條帶，測(cè)序后與目的序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)，一致性達(dá)到100%，將其連接至載體pKLAC1，酶切驗(yàn)證（圖1），構(gòu)建重組質(zhì)粒pKLAC1-AMPD。以該質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增分別獲得4.3 kb的APMD 基因表達(dá)框（pLAC4-αMF-AMPD-tLAC4）和2.6 kb 的篩選標(biāo)記基因表達(dá)框（pADH2-amdSTT），連接載體pMD 19T-simple，經(jīng)測(cè)序及BLAST比對(duì)表明成功構(gòu)建質(zhì)粒pTLA 和pT-amdS。

采用強(qiáng)啟動(dòng)子是實(shí)現(xiàn)外源基因高效表達(dá)的另一途徑，最常用的啟動(dòng)子包括S.cerevisiae 的磷酸甘油酸激酶基因（PGK）啟動(dòng)子和酸性磷酸酶基因（PHO5）啟動(dòng)子，K.lactis 的β-半乳糖苷酶基因（LAC4）啟動(dòng)子[3]。在實(shí)驗(yàn)室前期啟動(dòng)子研究工作中，發(fā)現(xiàn)S.cerevisiae 來(lái)源的pScGAL7 性能優(yōu)于K.lactis 自身來(lái)源的pLAC4（數(shù)據(jù)他處發(fā)表），因此以pScGAL7（301 bp）調(diào)控AMPD 的表達(dá)，構(gòu)建質(zhì)粒pTGA。

圖1 質(zhì)粒pKLAC1-AMPD 的酶切驗(yàn)證Fig.1 Enzymatic digestion of plasmid pKLAC1-AMPD

根據(jù)1.2.1 節(jié)所述方法，依次構(gòu)建質(zhì)粒pTGAamdS 和pTR，Kpn I 酶切后連接上述兩個(gè)質(zhì)粒得重組表達(dá)載體pTRGA-amdS，具體構(gòu)建流程見(jiàn)圖2，酶切驗(yàn)證見(jiàn)圖3。

圖2 重組表達(dá)載體pTRGA-amdS 的構(gòu)建Fig.2 Construction of recombinant expression vector pTRGA-amdS

圖3 重組表達(dá)載體pTRGA-amdS 酶切驗(yàn)證Fig.3 Enzymatic digestion of recombinant expression vector pTRGA-amdS

2.2 轉(zhuǎn)化子的篩選及驗(yàn)證

重組載體pTRGA-amdS 經(jīng)Sac II 酶切線性化后電轉(zhuǎn)化K.lactis GG799，與基因組中18S rDNA發(fā)生同源重組，將AMPD 基因整合到染色體中，α因子信號(hào)肽（α-Mating Factor，αMF）介導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)AMP 脫氨酶的分泌表達(dá)，amdS 基因編碼的乙酰胺酶能將培養(yǎng)基中的乙酰胺轉(zhuǎn)化為K.lactis 可利用的氮源，只有正確整合的重組菌才能在YCB 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，30 ℃培養(yǎng)3～4 d，挑取菌落明顯的轉(zhuǎn)化子，提取染色體基因組，設(shè)計(jì)特異性引物Int-F/R，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子PCR 擴(kuò)增片段大小為2 032 bp，而原始菌株無(wú)PCR 產(chǎn)物（圖4），篩選得到10 株陽(yáng)性重組菌，-70℃甘油管保藏待用。

圖4 重組菌K .lactis/pTRGA-amdS 的PCR 驗(yàn)證Fig.4 Integrated identification of recombinant K .lactis/pTRGA-amdS

2.3 重組菌AMPD 基因拷貝數(shù)的測(cè)定

以基因組中單拷貝的GAPDH 為內(nèi)參基因，PCR 擴(kuò)增得到941 bp 的目的片段，測(cè)序結(jié)果與K.lactis NRRL Y-1140 的GAPDH 基因序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)，一致性達(dá)到99.7%，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pTGAPDH，Xho I 和Bgl II 酶切驗(yàn)證（圖5）。采用RTQPCR 建立GAPDH 和AMPD 基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖6?？芍珿APDH 和AMPD 基因的熔解曲線均為單一峰，表明反應(yīng)過(guò)程中未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，特異性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為

y=-3.584 7x+39.988 和y=-3.357 3x+37.677，

相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.998 4 和0.999 1，擴(kuò)增效率分別為0.9 和0.985 4，符合RT-QPCR 絕對(duì)定量擴(kuò)增效率的要求。以稀釋后的陽(yáng)性重組菌染色體DNA為模板進(jìn)行RT-QPCR 反應(yīng)，GAPDH 和AMPD 基因的Ct 值如表3 所示，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算即可得到反應(yīng)體系中GAPDH 和AMPD 基因的初始拷貝數(shù)，可得10 株重組菌的AMPD 基因拷貝數(shù)從1～3 個(gè)。

圖5 質(zhì)粒pT-GAPDH 的酶切驗(yàn)證Fig.5 Enzymatic digestion of plasmid pT-GAPDH

K.lactis 染色體中存在68 個(gè)rDNA 串聯(lián)重復(fù)序列，每個(gè)單元由轉(zhuǎn)錄區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)組成，以rDNA序列為同源重組的整合位點(diǎn)兼具高效和穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)而備受青睞。Lin 等[27]利用2.7 kb 的rDNA 序列、URA3 缺陷型篩選標(biāo)記介導(dǎo)葡糖淀粉酶在S.cerevisiae 中整合表達(dá)，拷貝數(shù)為25～140。Wery 等[20]以3 kb rDNA 序列同源重組并通過(guò)G418 篩選得到50個(gè)拷貝的重組紅法夫酵母（P.rhodozyma）。Klabunde 等[18]以H.polymorpha 來(lái)源的2.4 kb 的25SNTS1-5S-NTS2 為同源重組位點(diǎn)構(gòu)建了多宿主適用的整合型載體，拷貝數(shù)為30～40。但是Steinborn 等[21]以A.adeninivoras 為宿主菌，選取H.polymorpha 來(lái)源的rDNA 不同位置的序列構(gòu)建了一系列重組載體，均得到單拷貝整合重組菌。相似的是，Wartmann等[22]研究以A.adeninivoras rDNA 為整合位點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)重組菌均以單拷貝或低拷貝整合。研究發(fā)現(xiàn)，rDNA 單元中整合位點(diǎn)的位置、載體的大小會(huì)影響整合拷貝數(shù)及穩(wěn)定性。目前對(duì)于rDNA 整合的分子機(jī)制尚不清楚，推測(cè)HOT 序列可能與整合穩(wěn)定性相關(guān)[28]，該序列是具有重組刺激活性的順式作用元件，能夠促進(jìn)或激活遺傳基因的交流，rDNA 中存在2個(gè)HOT 序列，分別位于35S rDNA 前體5’端轉(zhuǎn)錄區(qū)域的上游和3’ 端的下游，此外，rDNA 中存在的Fob1 因子、Sir2p、RAD52 因子和MRX 復(fù)合體因子等重要功能元件均會(huì)影響整合的效率和穩(wěn)定性[6，18]。另外，缺陷型篩選標(biāo)記或弱啟動(dòng)子的選擇下形成的強(qiáng)選擇壓力易于獲得高拷貝重組菌。本研究以完整的18S rDNA 序列為整合位點(diǎn)、amdS 為篩選標(biāo)記構(gòu)建重組載體，重組菌整合拷貝數(shù)為1～3。在此基礎(chǔ)上，可以通過(guò)改變整合位點(diǎn)在rDNA 的位置以及利用缺陷型啟動(dòng)子或弱啟動(dòng)子調(diào)控amdS 基因來(lái)篩選高拷貝重組菌。

圖6 GAPDH 和AMPD 基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Fig.6 Construction of standard curve of GAPDH and AMPD gene

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)重組菌AMPD 基因的整合拷貝數(shù)Table 3 Estimated AMPD gene copy number of recombinants by real-time fluorescent quantitative PCR

2.4 重組菌AMP 脫氨酶酶活測(cè)定

2.4.1 重組菌AMPD 基因拷貝數(shù)與AMP 脫氨酶酶活之間的關(guān)系 將含不同AMPD 基因整合拷貝的重組菌接種于YEPD 培養(yǎng)基中，測(cè)定發(fā)酵上清液重組AMP 脫氨酶酶活，結(jié)果如圖8 所示。重組菌基因組中AMPD 基因拷貝數(shù)的差異影響AMP 脫氨酶的表達(dá)水平，在同樣發(fā)酵條件下，只含1 個(gè)AMPD 基因拷貝的重組菌發(fā)酵上清液AMP 脫氨酶酶活性最低，含3 個(gè)AMPD 基因拷貝的重組菌酶活性最高，達(dá)到（444.44±23.15）U/mL，比前者提高了88%，含2個(gè)AMPD 基因拷貝的重組菌酶活介于1 個(gè)和3 個(gè)拷貝的重組菌，表明在一定范圍內(nèi)隨著拷貝數(shù)的增加，重組菌的酶活相應(yīng)提高，與Marx[9]等研究結(jié)果一致，因此，提高目的基因在宿主菌株中的拷貝數(shù)是提高外源蛋白表達(dá)量的有效途徑。雖然本試驗(yàn)中重組菌拷貝數(shù)較低，但在強(qiáng)啟動(dòng)子pScGAL7 的調(diào)控下外源基因仍得到高效表達(dá)。

圖7 重組菌AMP 脫氨酶酶活性與AMPD 基因拷貝數(shù)的關(guān)系Fig.7 Relationship between AMP deaminase activity and the copy number of the AMPD gene in recombinants

2.4.2 培養(yǎng)基成分對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響重組菌K.lactis/pTRGA-amdS 中AMPD 基因的表達(dá)受pScGAL7 調(diào)控，該啟動(dòng)子為非嚴(yán)格誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，由乳糖或半乳糖誘導(dǎo)，但不完全被葡萄糖抑制。在誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別測(cè)定重組菌菌體生長(zhǎng)量和發(fā)酵上清液AMP 脫氨酶酶活，結(jié)果如圖9所示。在K.lactis 中，pScGAL7 在缺少誘導(dǎo)物的條件下存在一定量的本底表達(dá)，AMP 脫氨酶酶活為（445±11.67）U/mL，誘導(dǎo)條件下，YEPDG 培養(yǎng)基中酶活為（560±20）U/mL，YEPG 培養(yǎng)基中酶活最高，為（590±13.33）U/mL，與非誘導(dǎo)條件下相比分別提高了25.8%和32.6%，而在不同培養(yǎng)基中重組菌菌體生長(zhǎng)量相當(dāng)，進(jìn)一步表明酶活的提高是由于誘導(dǎo)物存在下啟動(dòng)子調(diào)控外源蛋白表達(dá)的能力增強(qiáng)，且隨著誘導(dǎo)物濃度的增加，酶活相應(yīng)提高。

2.5 乳酸克魯維酵母整合表達(dá)體系穩(wěn)定性

在無(wú)選擇壓力條件下，與游離型表達(dá)載體相比，整合型表達(dá)載體具有在宿主菌基因組中穩(wěn)定遺傳的優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)1.2.7 節(jié)所述方法，對(duì)構(gòu)建的重組表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)定，重組菌傳代58 次后的穩(wěn)定性為98.59%，表明整合于K.lactis基因組中的外源基因具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

3 討論

以18S rDNA 為同源重組的整合位點(diǎn)構(gòu)建了適用于K.lactis 的整合型表達(dá)載體pTRGA-amdS，并實(shí)現(xiàn)了AMP 脫氨酶在宿主菌中的分泌表達(dá)。所構(gòu)建的載體在以下方面具有一定的優(yōu)勢(shì)：1）以rDNA為同源重組位點(diǎn)，外源基因整合于宿主細(xì)胞基因組中，且在無(wú)選擇壓力條件下穩(wěn)定遺傳；2）線性化重組載體后，同源重組片段去除了E.coli 來(lái)源的ori序列和氨芐青霉素抗性基因（Ampr），減小了載體的大小，同時(shí)提高了穩(wěn)定性和生物安全性[12]；3）以amdS 為篩選標(biāo)記，可直接從野生型菌株出發(fā)，不需要利用URA、LEU 或TRP 等營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記，省去了營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選，并避免了回復(fù)突變的問(wèn)題[2]，此外，也降低了使用G418、潮霉素等抗生素在篩選中的成本，不會(huì)對(duì)環(huán)境和人類產(chǎn)生危害；4）在整合拷貝數(shù)較低的情況下，強(qiáng)啟動(dòng)子pScGAL7調(diào)控外源基因的表達(dá)達(dá)到較高的胞外蛋白產(chǎn)量，另外，因rDNA 在K.lactis 中基因組中存在70 個(gè)左右拷貝，該表達(dá)載體也為同時(shí)共表達(dá)多個(gè)外源基因（如酵母分泌途徑中的輔助因子或分子伴侶等）提供了可能[7-8]。

與此同時(shí)，該表達(dá)載體也存在一定的不足之處，即重組菌整合拷貝數(shù)較低，推測(cè)可能原因一方面是本研究所選取的同源臂序列為完整的18S rDNA，該位點(diǎn)具有高度保守性，且同源重組片段缺少了HOT、Fob1 等重要功能元件，因此影響了整合的效率[6，18]，另一方面是調(diào)控篩選標(biāo)記的pADH2 為強(qiáng)啟動(dòng)子，重組菌只需達(dá)到較低拷貝即能在YCB 平板上生長(zhǎng)，不利于拷貝數(shù)的復(fù)制。為了避免上述情況，后續(xù)試驗(yàn)可以從兩個(gè)角度出發(fā)，一是對(duì)K.lactis的rDNA 序列進(jìn)行分析，選擇合適的同源臂序列，二是將amdS 基因前的啟動(dòng)子替換為缺陷型啟動(dòng)子或弱啟動(dòng)子，通過(guò)增強(qiáng)選擇壓力來(lái)篩選高拷貝重組菌。

4 結(jié)語(yǔ)

利用本研究構(gòu)建的表達(dá)載體能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因的穩(wěn)定表達(dá)，為K.lactis 進(jìn)行分子改造提供了理想工具。因目前對(duì)于rDNA 的重要元件、重組的分子機(jī)制研究尚不完善，通過(guò)不斷深入研究，以rDNA 重復(fù)單元作為同源重組的整合位點(diǎn)將在基因工程應(yīng)用中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。