李明 張振宇

（河南省濟(jì)源市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心459000）

為防治各類疾病、降低死亡率，獸藥廣泛應(yīng)用于蛋雞養(yǎng)殖，但由于獸藥濫用、誤用及不遵守休藥期規(guī)定，導(dǎo)致雞蛋中有藥物殘留，這些藥物通過食物鏈在人體內(nèi)蓄積，產(chǎn)生耐藥性，還可致基因突變、致畸、致癌。

檢測(cè)獸藥殘留的方法較多，常見的主要有液相色譜法[1-2]、氣相色譜質(zhì)譜法[3]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4-5]、酶聯(lián)免疫法[6]等。根據(jù)雞蛋市場(chǎng)流通快的特點(diǎn)，需建立短時(shí)間內(nèi)、高通量、一次性準(zhǔn)確測(cè)定雞蛋中獸藥多殘留。為此本項(xiàng)目開展雞蛋獸藥多殘留檢測(cè)技術(shù)的研究，通過對(duì)樣品處理、色譜、柱譜條件的優(yōu)化等建立了樣品一次性處理、同時(shí)測(cè)定3大類17種獸藥殘留的超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜方法。相比現(xiàn)有方法具有更高的效率、更簡(jiǎn)單的前處理過程，且各項(xiàng)性能滿足殘留分析要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

UPLC Xevo TQ MS超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters公司)；MS 3 basic漩渦混合器（IKA公司）；高速冷凍離心機(jī)(香港力康公司)；TTL-DCII型氮吹儀（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試劑與材料

乙腈、甲醇為色譜純；甲酸為優(yōu)級(jí)純；17種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品全部購于阿爾塔科技有限公司，標(biāo)準(zhǔn)液濃度為100μg/ml。6個(gè)同位素內(nèi)標(biāo)分別為氯霉素-D5、甲砜霉素-D3、氟苯尼考-D3；恩諾沙星-D5、達(dá)氟沙星-D3；磺胺間二甲氧嘧啶-D6；Oasis PRiME HLB固相萃取柱（Waters公司，60mg/3ml）。

1.3 色譜條件

色譜柱：CORTECS UPLC C18 Column，（1.6μm，2.1mm X 100mm）；流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為0.2%甲酸水梯度洗脫；流速為0.4ml/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為10μL。

1.4 質(zhì)譜條件

電離方式：除酰胺醇類采用電噴霧負(fù)離子模式，其他均為電噴霧正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）采集；毛細(xì)管電壓2.7kV離子源溫度為150℃；脫溶劑氣溫度為500℃；脫溶劑氣流量為1000L/h。

1.5 樣品處理

稱取樣品2.00g，置于50ml離心管內(nèi)，加適量內(nèi)標(biāo)液，再加無水硫酸鈉4g，最后加入0.2%甲酸乙腈10ml，渦旋0.5min后震蕩提取15min。12000r/min離心5min，取5ml上清液，過Oasis PRiME HLB柱，用3ml0.2%甲酸乙腈過柱，收集全部流出液，于50℃下用溫和氮?dú)獯抵两伞２⒂?ml 10%乙腈溶解，渦旋過0.22μm濾頭后供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理優(yōu)化

2.1.1 樣品提取

試驗(yàn)采用0.2%甲酸、1%甲酸和2%甲酸3種不同比例酸化乙腈結(jié)合的方式沉淀蛋白并提取目標(biāo)物，使用無水硫酸鈉除去樣品和提取液中的水分。同時(shí)比較了乙腈和樣品比例為3∶1、4∶1和5∶1分別提取。試驗(yàn)表明，采取2%甲酸乙腈和樣品比例為5∶1的蛋白質(zhì)沉淀效果最好，但在此條件下對(duì)磺胺類回收率較低，這是由于在酸性較強(qiáng)時(shí)，磺胺類堿性化合物的離子化程度增大，導(dǎo)致在有機(jī)相中的溶解性減弱。用0.2%甲酸乙腈、5∶1比提取并沉淀蛋白的條件，其回收率可大幅提高（回收率在60%以上）。所以，本試驗(yàn)選用該條件進(jìn)行樣品提取。

2.1.2 樣品凈化

由于雞蛋中存在大量磷脂、脂肪等親脂性雜質(zhì)，極大干擾目標(biāo)化合物的分析，同時(shí)降低色譜柱壽命。如果采用專一性較強(qiáng)的萃取小柱對(duì)測(cè)定某種或某類化合物效果較好，往往對(duì)其他組分回收率較差，不能滿足3大類性質(zhì)差異較大的17種獸藥殘留測(cè)定。

本研究采用Oasis MCX、Oasis HLB、Oasis PRiME HLB 3種固相萃取小柱進(jìn)行樣品凈化處理比較。Oasis MCX和Oasis HLB萃取小柱要求大比例水相的上樣才會(huì)使目標(biāo)化合物在柱子上保留，這就要求把提取液中的乙腈置換成水相，而且各待測(cè)物在不同pH下的固相萃取柱上保留差異較大。而Oasis PRiME HLB萃取小柱可以用乙腈的提取液直接過柱，將磷脂及非極性干擾物吸附于固相萃取柱中，對(duì)所有待測(cè)物無吸附，這樣既能有效去除干擾物，又確保了所有待測(cè)組分無損失，同時(shí)在凈化過程中也省去了溶劑的轉(zhuǎn)換過程，簡(jiǎn)化操作步驟。本實(shí)驗(yàn)采用Oasis PRiME HLB萃取小柱進(jìn)行樣品凈化。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱及流動(dòng)相的選擇

本方法選取CORTECS UPLC C18柱2.1mm×100mm，1.6μm，Waters BEH C18柱2.1×100，1.7μm，和HSS T3 2.1×100，1.8μm 3種色譜柱進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)。本研究選擇了3大類17種獸藥。本實(shí)驗(yàn)通過色譜柱的選擇與流動(dòng)相優(yōu)化達(dá)到此目的。根據(jù)各色譜柱的特點(diǎn)分別對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)。經(jīng)試驗(yàn)，上述3種化合物在CORTECS UPLC C18的分離優(yōu)于HSS T3色譜柱、BEH C18色譜柱。本試驗(yàn)采用該色譜柱進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)優(yōu)化其色譜梯度洗脫程序見表1（流動(dòng)相A為乙腈、流動(dòng)相B為0.2%甲酸水）。

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

除酰胺醇類采用負(fù)離子模式，其他均為正離子模式，分別對(duì)錐孔電壓、碰撞能量和選擇離子進(jìn)行充分優(yōu)化，并確定其最佳錐孔電壓和碰撞能量的電壓值。對(duì)上述質(zhì)譜條件優(yōu)化后，可滿足測(cè)定雞蛋中獸殘各組分定性、定量的要求。定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量見表2。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

為降低基質(zhì)效應(yīng)影響，保證檢測(cè)結(jié)果可靠準(zhǔn)確，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量，采用不含待測(cè)物的雞蛋空白基質(zhì)溶液配制質(zhì)量濃度，喹諾酮類、磺胺類為0.5，1，5，10，20，50ng/ml，酰胺醇類為0.1，0.2，0.5，2，5，10ng/ml一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)樣峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積比值與質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)線性回歸方程。結(jié)果表明，在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)所有組分線性良好，相關(guān)系數(shù)r均在0.993～0.999。以3倍信噪比計(jì)算得到的檢出限在0.1～10μg/kg內(nèi)，可滿足雞蛋中相應(yīng)獸藥殘留測(cè)定的要求。

表1 色譜梯度洗脫程序

表2 酰胺醇類、喹諾酮類、磺胺類及內(nèi)標(biāo)定性、定量離子及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量

2.3.2 回收率、精密度

根據(jù)實(shí)際檢出能力制備了1.0，5.0，10.0μg/kg 3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的陽性雞蛋樣品，每個(gè)水平5平行試驗(yàn)，3個(gè)水平樣品的回收率在61.8%～117%，RSD在1.2%～9.7%。方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性良好。

3 結(jié)論

本文建立了無水硫酸鈉除水、0.2%甲酸乙腈溶液一次性提取及Oasis PRiME HLB固相萃取超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)同時(shí)測(cè)定雞蛋中酰胺醇類、喹諾酮類、磺胺類17種獸藥殘留方法。該法與現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相比在保證準(zhǔn)確性好、靈敏度高的同時(shí)，前處理方法更簡(jiǎn)單快速，為雞蛋同時(shí)測(cè)定多種獸藥殘留的研究提供了數(shù)據(jù)和基礎(chǔ)。