陳廷玉，王東偉，張金波，王 偉，王景濤，盛顏良，盧春鳳*

（佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007）

異煙肼（isoniazid，INH）是臨床上治療結(jié)核病的首選藥物[1]，但因其具有嚴(yán)重的肝毒性[2-3]，臨床應(yīng)用受到了極大的限制。到目前為止，INH的肝毒性機(jī)制尚未闡明，因此，闡明其肝毒性機(jī)制并尋找安全有效的保肝藥物具有重要的意義。槲皮素（quercetin，Que）是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗肝纖維化、抗氧化和清除自由基等多種作用[4-6]，是具有臨床應(yīng)用前景的抗氧化劑。前期研究發(fā)現(xiàn)，INH能誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生DNA損傷，槲皮素對其具有保護(hù)作用[7-8]。因此，本實(shí)驗(yàn)以人正常肝細(xì)胞（L-02細(xì)胞）為研究對象，從細(xì)胞水平研究INH肝細(xì)胞毒性機(jī)制，重點(diǎn)探討ROS/Caspase-3信號(hào)通路在INH誘導(dǎo)L-02細(xì)胞凋亡中的作用及槲皮素的保護(hù)效應(yīng)，以期為臨床尋找安全有效的防治INH肝毒性的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

L-02細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；異煙肼、槲皮素、Rho-123和DCFH-DA均為Sigma公司產(chǎn)品；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Hoechst33258染色試劑盒為杭州碧云天公司產(chǎn)品；兔抗Caspase-3多克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及試驗(yàn)分組 L-02細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞生長情況，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。將L-02細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對照組，給予等體積的無血清培養(yǎng)基；INH組，給予10 mmol/L INH；25μmol/L槲皮素組，給予10 mmol/L INH和25μmol/L槲皮素；50μmol/L槲皮素組，給予10 mmol/L INH和50μmol/L槲皮素。

1.2.2 MTT法檢測L-02細(xì)胞存活率 L-02細(xì)胞經(jīng)上述處理24 h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20μL，放入CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。吸棄96孔板內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μL DMSO，振蕩10 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解。使用酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度值D（570），計(jì)算細(xì)胞相對存活率。

1.2.3 細(xì)胞上清液中LDH活性檢測 L-02細(xì)胞經(jīng)上述處理24 h后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，離心，取上清液100μL，加入50μL蒸餾水和250μL基質(zhì)緩沖液，混勻，37℃水浴15 min后，加入250μL 2，4-二硝基苯肼，混勻，37℃水浴15 min，再加入0.4 mmol/L NaOH 2.5 mL，室溫放置3 min后，用酶標(biāo)儀在440 nm處測其吸光度值D（440）。按下列公式計(jì)算細(xì)胞LDH活性。

1.2.4 Hoechst 33258染色法檢測細(xì)胞凋亡 L-02細(xì)胞經(jīng)上述處理24 h后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗2次，加入固定液500μL，4℃固定10 min，吸棄固定液，用PBS洗2次。然后加入Hoechst 33258染色液500μL，避光染色5 min。棄去染色液，用冷PBS洗2次，加抗熒光淬滅劑，封片。采用激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm，在熒光顯微鏡下觀察、拍照，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 細(xì)胞線粒體ROS水平的檢測 收集各組細(xì)胞，用差速離心法分離線粒體，加入DCFH-DA，使其終濃度為2μg/mL，37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育20 min。吸去培養(yǎng)液，用冷PBS洗3遍，并棄去殘液，以去除非特異性熒光，然后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)DCF熒光強(qiáng)度并拍照。利用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析，并計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。

1.2.6 細(xì)胞線粒體膜電位的檢測 收集各組細(xì)胞，用差速離心法分離線粒體，加入Rhodamine123染色液，使其終濃度為5 mg/L，37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20 min；冷PBS洗3遍去除非特異性熒光后，用激光共聚焦測定激發(fā)波長488 nm下的熒光強(qiáng)度值，并拍照。利用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析，并計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。

1.2.7 Western blot法檢測細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá) L-02細(xì)胞經(jīng)上述處理24 h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。每孔上樣10 μg總蛋白，在12%SDS-PAGE中進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h后，加入用封閉液稀釋的一抗，室溫孵育1 h，然后4℃冰箱過夜。TBST洗膜后，加入用封閉液稀釋的二抗，室溫孵育1 h。再用TBST洗膜，在暗室中用Super ECL進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，X線膠片曝光顯影。掃描膠片，用Quantity One 4.6.2圖像分析軟件對目標(biāo)蛋白進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以xˉ±s表示。應(yīng)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。INH組與對照組比較，采用兩組間t檢驗(yàn)，給藥組與INH組比較采用ANOVA進(jìn)行分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 L-02細(xì)胞存活率

L-02細(xì)胞存活率檢測結(jié)果見圖1，L-02細(xì)胞經(jīng)INH處理24 h后，細(xì)胞的存活率明顯降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；50μmol/L槲皮素組細(xì)胞存活率明顯增加，與INH組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 L-02細(xì)胞上清液中LDH活性

L-02細(xì)胞上清液中LDH活性檢測結(jié)果見圖2，INH組細(xì)胞上清液中LDH活性顯著高于對照組（P＜0.01）；25和50μmol/L槲皮素組細(xì)胞上清液中LDH活性明顯低于INH組（P＜0.05或P＜0.01），表明槲皮素可抑制細(xì)胞LDH的漏出，且50μmol/L槲皮素組抑制作用更顯著。

圖1 L-02細(xì)胞存活率

圖2 L-02細(xì)胞上清液中LDH活性

2.3 L-02細(xì)胞凋亡率

L-02細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果見圖3，L-02細(xì)胞經(jīng)INH處理24 h后，細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組（P＜0.01）；25和50μmol/L槲皮素組細(xì)胞凋亡率明顯低于INH組（P＜0.05或P＜0.01），表明槲皮素可抑制L-02細(xì)胞凋亡，且50μmol/L槲皮素組抑制作用更顯著。

圖3 L-02細(xì)胞凋亡率

2.4 L-02細(xì)胞線粒體ROS水平

結(jié)果見圖4，與對照組比較，INH組L-02細(xì)胞線粒體ROS水平顯著升高（P＜0.01）；25和50 μmol/L槲皮素組ROS水平明顯低于INH組（P＜0.05或P＜0.01），表明槲皮素可抑制細(xì)胞線粒體ROS的生成，且50μmol/L槲皮素組抑制作用更顯著。

圖4 L-02細(xì)胞線粒體ROS水平

2.5 L-02細(xì)胞線粒體膜電位

L-02細(xì)胞線粒體膜電位檢測結(jié)果見圖5，與對照組比較，INH組L-02細(xì)胞線粒體ΔΨm顯著降低（P＜0.01）；25和50μmol/L槲皮素組細(xì)胞線粒體ΔΨm明顯升高，與INH組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），表明槲皮素對細(xì)胞線粒體有保護(hù)作用，且50 μmol/L槲皮素組的保護(hù)作用更明顯。

圖5 L-02細(xì)胞線粒體膜電位

2.6 L-02細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)

Western blot檢測細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)的結(jié)果見圖6，INH組細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)顯著高于對照組（P＜0.01）；25和50 μmol/L槲皮素組細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)明顯低于INH組（P＜0.05或P＜0.01），表明槲皮素能抑制Caspase-3蛋白表達(dá)，且50μmol/L槲皮素組抑制作用更顯著。

圖6 L-02細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)

3 討論

迄今為止，INH肝毒性的具體機(jī)制尚未闡明。研究表明，線粒體是多種外源化合物細(xì)胞毒性的主要靶點(diǎn)，也是細(xì)胞ROS產(chǎn)生的主要場所[9-12]。近年來，線粒體在細(xì)胞凋亡機(jī)制研究中的作用越來越受到關(guān)注[13-14]。因此，本實(shí)驗(yàn)以L-02細(xì)胞為研究對象，從細(xì)胞凋亡的角度探討INH肝細(xì)胞毒性的機(jī)制，重點(diǎn)探討ROS/Caspase-3信號(hào)通路在INH誘導(dǎo)L-02細(xì)胞凋亡中的作用，以及槲皮素對INH所致肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，INH處理L-02細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率明顯增加，而槲皮素能明顯降低細(xì)胞凋亡率，表明INH能誘導(dǎo)L-02細(xì)胞凋亡，槲皮素對INH誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞凋亡具有保護(hù)效應(yīng)。

研究表明，在細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)，線粒體的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為線粒體膜通透性增高，線粒體ΔΨm降低[15]。那么INH誘導(dǎo)L-02細(xì)胞凋亡是否與ROS介導(dǎo)的線粒體損傷有關(guān)？本實(shí)驗(yàn)檢測了細(xì)胞存活率[16]、LDH漏出量及線粒體ΔΨm值。正常情況下LDH存在于細(xì)胞內(nèi)，只有當(dāng)細(xì)胞膜損傷時(shí)，它才能釋放出來，LDH釋放或漏出是反映細(xì)胞膜受損的重要指標(biāo)，LDH漏出量的多少可間接反映細(xì)胞受損的程度[17-19]。線粒體ΔΨm是反映線粒體功能的關(guān)鍵指標(biāo)，線粒體ΔΨm降低，提示細(xì)胞發(fā)生線粒體損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，INH處理后L-02細(xì)胞存活率明顯降低，LDH漏出明顯增加；而槲皮素能明顯增加L-02細(xì)胞存活率，使細(xì)胞LDH漏出減少。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)INH作用L-02細(xì)胞后，線粒體ΔΨm明顯降低，而槲皮素可使細(xì)胞線粒體ΔΨm明顯升高，表明INH可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體損傷，使膜通透性增加，促進(jìn)LDH漏出；槲皮素對線粒體損傷有一定的保護(hù)作用[20]，使膜通透性降低，進(jìn)而減少LDH的漏出。線粒體ΔΨm降低是細(xì)胞凋亡的主要事件，線粒體ΔΨm下降可導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，激活線粒體細(xì)胞凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷[21-23]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，L-02細(xì)胞經(jīng)INH處理后，細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，而槲皮素作用后能明顯下調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)，表明INH能造成L-02細(xì)胞線粒體損傷，激活Caspase凋亡蛋白酶，啟動(dòng)細(xì)胞線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)L-02細(xì)胞凋亡；槲皮素可保護(hù)線粒體膜，阻斷線粒體細(xì)胞凋亡途徑[24]，抑制L-02細(xì)胞凋亡的發(fā)生。那么INH是如何導(dǎo)致細(xì)胞線粒體ΔΨm降低，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡？研究表明，ROS的增加可損傷細(xì)胞線粒體膜，導(dǎo)致細(xì)胞線粒體ΔΨm降低，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[25-26]。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測了線粒體ROS水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-02細(xì)胞經(jīng)INH處理后，線粒體ROS水平顯著升高，而槲皮素能降低線粒體ROS水平，提示INH能促進(jìn)線粒體ROS生成，降低細(xì)胞線粒體ΔΨm，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；槲皮素可減少線粒體ROS的生成，增高細(xì)胞線粒體ΔΨm，抑制ROS/Caspase-3信號(hào)通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。

總之，在本實(shí)驗(yàn)條件下，INH能誘導(dǎo)L-02細(xì)胞發(fā)生凋亡，ROS/Caspase-3信號(hào)通路參與了其凋亡的過程；而槲皮素對INH誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過抑制ROS釋放，改善線粒體功能，抑制ROS/Caspase-3信號(hào)通路阻斷線粒體細(xì)胞凋亡途徑，從而抑制L-02細(xì)胞凋亡，但具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。