姜雪霞，王 盼，劉艷飛，張 艷，白劍英*

（山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)衛(wèi)教研室，山西太原 030001）

甲醛是一種室溫下具有刺激性氣味的無色氣體，屬高分子有機(jī)化合物，極易溶于水、醇和其他有機(jī)溶劑[1]。甲醛被廣泛用于醫(yī)療固定劑、洗滌劑、化妝品、食品、橡膠、化肥、木材、皮革及紡織品等各種消費(fèi)性產(chǎn)品[2]。隨著甲醛的廣泛應(yīng)用，人類對甲醛污染的關(guān)注也逐漸增加。甲醛具有高活性，可與蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子反應(yīng)[3]。大量研究證實(shí)甲醛具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性、免疫系統(tǒng)毒性、生殖系統(tǒng)毒性及心血管系統(tǒng)毒性等[4]。與許多外源物質(zhì)一樣，甲醛進(jìn)入機(jī)體后也需在肝臟進(jìn)行代謝解毒。動物實(shí)驗和體外實(shí)驗證實(shí)甲醛可引起肝細(xì)胞形態(tài)改變，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[5-6]，提示甲醛具有一定的肝臟損傷作用。肝臟是膽固醇代謝的主要場所，肝臟受損的早期表現(xiàn)是脂質(zhì)代謝紊亂，而膽固醇代謝紊亂又與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)[7]。近年來越來越多的證據(jù)將肝臟中膽固醇平衡的改變和游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）積累與非酒精性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）聯(lián)系在一起[8-9]。本實(shí)驗選擇人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞作為研究對象，探究甲醛能否引起肝細(xì)胞游離膽固醇的積累及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。

1.2 主要儀器及試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱Galaxy 170S，購自德國Eppendorf公司；倒置顯微鏡BX51，購自日本Olympus公司；酶標(biāo)儀Model 680，購自美國Bio-rad公司；電泳槽及電泳儀，均購自北京六一儀器廠；氮吹儀YGC-96，購自中國成都雅源科技有限公司。

甲醛（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%）購自美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，購自美國Hyclone公司；新生牛血清，購自杭州四季青生物工程材料有限公司；E1006游離膽固醇酶法測定試劑盒，購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；兔抗人固醇元件結(jié)合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2，SREBP-2）多克隆抗體，購自美國Abcam公司；兔抗人羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶 （hydroxy mothylglutaryl coenzyme A reductase，HMGCR）多克隆抗體，購自美國Bioworld公司；兔抗人低密度脂蛋白受體（lowdensity lipoprotein receptor，LDLR）多克隆抗體，購自美國Protein Tech公司；兔抗人膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（acyl coenzyme A-cholesterol acyltransferase，ACAT）多克隆抗體，購自美國Epitomics公司；BCA蛋白定量試劑盒，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠及羊抗兔二抗、β-actin抗體，均購自武漢Boster公司；ECL化學(xué)發(fā)光液，購自美國Thermo公司；甲醛染毒液的配制：準(zhǔn)確吸取一定量的甲醛原液，用含10%小牛血清的完全培養(yǎng)基將其配制成濃度為12.5 mmol/L甲醛溶液，然后按梯度稀釋至所需要的濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%小牛血清的完全培養(yǎng)基中，放置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中，隔天換液，選取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

1.3.2 實(shí)驗分組 根據(jù)前期細(xì)胞毒性試驗結(jié)果[10]，實(shí)驗分為6組，分別是陰性對照組（完全培養(yǎng)基），甲醛處理組（0.004、0.02、0.1 mmol/L），兩個陽性對照組即1 mmol/L 油酸（oleic acid，OA）和2.5 μg/mL布雷非德菌素A （brefeldin A，BFA）。

1.3.3 肝細(xì)胞內(nèi)FC的測定 選取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞長至75%～80%，按上述分組進(jìn)行處理，每組設(shè)置6個平行樣，分別處理24和48 h后，用PBS清洗1次，每孔加750 μL的0.25%胰蛋白酶，鏡下觀察，細(xì)胞呈現(xiàn)皺縮時吸棄胰蛋白酶，向每孔加500μL PBS，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，分別取250μL的細(xì)胞懸液分裝于兩個EP管中。取250μL細(xì)胞懸液加入含有2 mL的異丙醇-己烷-水（體積比為80∶20∶2）中，充分混勻，室溫下避光放置30 min，然后加入500μL己烷-乙醚（體積比為1∶1），充分混勻，室溫避光孵育10 min，最后加入1 mL蒸餾水，充分混勻，室溫避光孵育20 min，直至水相和有機(jī)相分離。吸取400μL上層有機(jī)相于標(biāo)記好的玻璃管中，用氮吹儀吹干，然后采用甘油磷酸氧化酶法（GPO-POD）分析各組FC含量。另取250μL細(xì)胞懸液用BCA法進(jìn)行蛋白定量。

1.3.4 Western blot檢測膽固醇代謝相關(guān)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞處理同1.3.3，每組設(shè)置3個平行樣。染毒結(jié)束后，用PBS清洗2次，然后向每孔加入200μL上樣緩沖液，收集蛋白并用BCA法進(jìn)行蛋白定量。用聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，濃縮膠為5%，分離膠10%，上樣量為20μg，80 V電壓電泳90 min。用濕轉(zhuǎn)移法（400 mA，90 min）將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；用含5%脫脂奶粉的PBST（含吐溫20的PBS）室溫封閉1 h；分別加一抗（SREBP-2、HMGCR、ACAT、LDLR和β-actin，均為1∶1 000稀釋）4℃過夜；次日用PBST漂洗3次，每次10 min；用辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再用PBST清洗3次，每次10 min；加ECL發(fā)光液作用3 min后曝光，膠片于暗室中顯影并定影，并用HPG4050惠普掃描儀對膠片進(jìn)行掃描，最后采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行蛋白條帶的半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗結(jié)果均用xˉ±s表示，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。多組間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析（One way ANOVA）。進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較，若方差齊，采用LSD檢驗；若方差不齊，采用Games-Howell檢驗。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 甲醛對Hep G2細(xì)胞內(nèi)FC含量的影響

如圖1所示，與陰性對照組相比，各組FA染毒24 h，肝細(xì)胞內(nèi) FC 含量明顯增加（P＜0.05）；0.02 和0.1 mmol/L FA染毒48 h后，肝細(xì)胞內(nèi)FC含量顯著升高（P＜0.05）。

2.2 甲醛對HepG2細(xì)胞膽固醇合成途徑相關(guān)蛋白SREBP-2和HMGCR表達(dá)的影響

由圖2可知，與陰性對照組相比，染毒24 h后，N-SREBP-2（即SREBP-2的活性形式）蛋白表達(dá)在不同濃度FA組和OA組無明顯變化，僅在BFA組升高（P＜0.05）；而染毒48 h后，N-SREBP-2的表達(dá)水平僅在0.1 mmol/L FA組明顯降低（P＜0.05）。HMGCR蛋白表達(dá)水平在染毒24 h和48 h后均高于陰性對照組（P＜0.05）。提示FA通過誘導(dǎo)HMGCR蛋白的表達(dá)以增加肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成。

圖1 不同濃度的甲醛對肝細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇含量的影響

圖2 不同濃度的甲醛對肝細(xì)胞SREBP-2和HMGCR蛋白表達(dá)的影響

2.3 甲醛對Hep G2細(xì)胞膽固醇酯化相關(guān)蛋白ACAT表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示（圖3），F(xiàn)A染毒24 h后，各處理組ACAT蛋白表達(dá)水平均低于陰性對照組（P＜0.05）；在染毒48 h后，ACAT蛋白表達(dá)水平在0.02和0.1 mmol/L FA 組明顯降低（P＜0.05），而在 OA 組和BFA組明顯增加（P＜0.05）。提示FA可通過降低ACAT蛋白的表達(dá)水平，從而減少膽固醇酯的生成，促使胞內(nèi)FC水平增加，可能會加重其對肝細(xì)胞的毒性作用。

圖3 不同濃度的甲醛對肝細(xì)胞ACAT蛋白表達(dá)的影響

2.4 甲醛對Hep G2細(xì)胞重攝取途徑相關(guān)蛋白LDLR表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示（圖4），與陰性對照組相比，F(xiàn)A染毒24 h后，除BFA組外，LDLR蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）；染毒48 h后，HepG2細(xì)胞內(nèi)LDLR蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。提示FA染毒后，肝細(xì)胞對胞外低密度脂蛋白重攝取減少。

圖4 不同濃度的甲醛對肝細(xì)胞LDLR蛋白表達(dá)的影響

3 討論

甲醛是一種廣泛存在的環(huán)境污染物，除可引起眼、鼻、咽等部位的刺激及不適感，還具有致敏毒性及致畸作用，甚至?xí)斐扇硇约膊11]?；谄淇梢鸨茄拾┖桶籽?，甲醛被世界衛(wèi)生組織列為人類致癌物[12]。甲醛代謝所需要的酶廣泛存在于肝臟中，使得甲醛在肝細(xì)胞中可迅速代謝為甲酸，并進(jìn)一步氧化為二氧化碳排出體外，這個過程伴隨一定量的氧自由基產(chǎn)生（ROS）[3，13]。有報道指出隨著甲醛染毒濃度的增加，小鼠肝臟組織病理學(xué)損傷程度亦加重，表現(xiàn)為細(xì)胞水腫，細(xì)胞變性甚至細(xì)胞壞死，且肝損傷程度呈現(xiàn)劑量依賴性[14]，這提示甲醛具有肝臟損傷作用。而本課題組前期實(shí)驗也證實(shí)，當(dāng)甲醛濃度達(dá)到一定水平時，隨著染毒劑量的增加，其對HepG2細(xì)胞活性抑制作用明顯增加[10]，提示高濃度的甲醛對肝細(xì)胞具有直接損傷作用。

本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)FA處理HepG2細(xì)胞24 h后，肝細(xì)胞內(nèi)FC含量明顯增加；且延長作用時間至48 h后，0.02和0.1 mmol/L FA仍可使HepG2細(xì)胞內(nèi)FC含量明顯增加。說明甲醛可引起HepG2細(xì)胞游離膽固醇的積累，誘發(fā)肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝的紊亂進(jìn)而加劇了對肝細(xì)胞的損傷程度。肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇平衡的維持與膽固醇的從頭合成、從血液中的重攝取及轉(zhuǎn)運(yùn)到血液和膽汁等多種途徑相關(guān)[15]，而這些途徑受阻很可能造成膽固醇在肝細(xì)胞內(nèi)的代謝紊亂。

SREBP-2是肝臟膽固醇代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，它在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上以無活性的蛋白質(zhì)前體存在，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇缺乏時，SREBP-2在SREBP裂解激活蛋白護(hù)送下進(jìn)入高爾基體進(jìn)行兩步有效剪切，釋放出具有轉(zhuǎn)錄活性的片段即N-SREBP-2，后者可遷移至細(xì)胞核，上調(diào)膽固醇合成的關(guān)鍵酶系，如HMGCoA合成酶及HMGCR等基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成[16-17]；然而細(xì)胞內(nèi)高水平的膽固醇又可反饋性抑制N-SREBP-2活性[18]。HMGCR是SREBP-2主要的靶基因，在肝臟中表達(dá)最高[19]，它是細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成過程中最關(guān)鍵的限速酶，其活性增加可使肝臟內(nèi)膽固醇合成增多[20]。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)甲醛染毒24 h后，NSREBP-2蛋白表達(dá)水平在HepG2細(xì)胞內(nèi)無明顯變化，而染毒48 h，N-SREBP-2蛋白表達(dá)水平在0.1 mmol/L FA染毒組明顯降低，我們推測這可能與胞內(nèi)高濃度膽固醇對SREBP-2的負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)；而HMGCR蛋白表達(dá)水平在甲醛染毒24和48 h后均明顯增加，且伴隨著胞內(nèi)FC的增加，說明甲醛可通過上調(diào)膽固醇合成關(guān)鍵蛋白HMGCR的表達(dá)來增加胞內(nèi)膽固醇的合成。由上述結(jié)果可見，本實(shí)驗中HMGCR蛋白表達(dá)水平的改變與SREBP-2蛋白表達(dá)水平的改變并不一致，說明HMGCR蛋白表達(dá)水平的增加并不是經(jīng)由SREBP-2途徑，這可能與HMGCR基因有多個啟動子在多個轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)起作用有關(guān)。有報道提示在培養(yǎng)的細(xì)胞中，SREBP-1a和SREBP-2同時參與調(diào)節(jié)膽固醇合成的有關(guān)基因[21-22]。我們推測甲醛有可能通過影響其他調(diào)控因子來上調(diào)HMGCR蛋白的表達(dá)進(jìn)而增加FC的含量。

ACAT是細(xì)胞內(nèi)唯一催化FC與長鏈脂肪酸形成膽固醇酯的酶，細(xì)胞中FC過度積累可形成膽固醇結(jié)晶，并對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，ACAT的主要功能是防止游離膽固醇的過度產(chǎn)生，減少對細(xì)胞的脂毒性[23]。在體內(nèi)或體外的完整細(xì)胞中，抑制ACAT的活性可通過增加FC和降低膽固醇酯的含量以達(dá)到細(xì)胞中膽固醇的重新分布[24]。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)FA染毒24 h或0.02和0.1 mmol/L FA染毒48 h后，均可使HepG2細(xì)胞內(nèi)ACAT的蛋白表達(dá)水平明顯降低。本結(jié)果提示甲醛可通過降低ACAT的表達(dá)，減少膽固醇酯的形成，從而引起FC的積累，加重了對肝細(xì)胞的毒性作用。

細(xì)胞內(nèi)膽固醇除自身合成外，還來源于細(xì)胞外脂蛋白的吸收[25]。LDLR可特異性識別LDL顆粒的apoB-100，將LDL遞送到細(xì)胞中，再與溶酶體融合，其中膽固醇酯水解為FC和脂肪酸，增加胞內(nèi)FC含量[26]；而當(dāng)胞內(nèi)游離膽固醇濃度增加時，肝臟又通過抑制LDLR合成，減少LDL重攝取，防止膽固醇在細(xì)胞內(nèi)過度積累[27]。本研究發(fā)現(xiàn)FA染毒24和48 h后，LDLR蛋白表達(dá)水平均明顯降低，抑制肝細(xì)胞對胞外LDL重攝取，從而限制了FC在肝細(xì)胞內(nèi)過度積累，這可能與細(xì)胞內(nèi)高濃度的FC對其進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。

綜上可知，甲醛引起HepG2細(xì)胞內(nèi)FC積累，可能與HMGCR表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致膽固醇從頭合成增加有關(guān)；也可能與膽固醇酯化蛋白ACAT表達(dá)下調(diào)降低酯化水平有關(guān)聯(lián)。但在本實(shí)驗劑量范圍內(nèi)，肝細(xì)胞仍有一定的代償能力，可反饋性抑制LDLR蛋白的表達(dá)，這在一定程度上限制肝細(xì)胞內(nèi)FC進(jìn)一步增加。但目前對甲醛引起肝細(xì)胞內(nèi)FC代謝異常關(guān)注仍較少，對于甲醛如何引起肝細(xì)胞內(nèi)FC水平增加，仍需要進(jìn)一步研究。