周魯林，楊潤(rùn)坤，張 文，馮 林，肖 汀，程書鈞，張開泰，張 蕾*

（1.國(guó)家癌癥中心/國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，癌發(fā)生及預(yù)防分子機(jī)理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院結(jié)直腸腫瘤外科，哈爾濱150086；3.國(guó)家癌癥中心/國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院免疫學(xué)研究室，北京 100021；4.國(guó)家癌癥中心/國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院內(nèi)鏡科，北京 100021）

腫瘤是一個(gè)高度異質(zhì)性的復(fù)雜系統(tǒng)，腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中的各類細(xì)胞相互影響、相互依存[1]。解析腫瘤組織中各類細(xì)胞亞群的特征和分布是認(rèn)識(shí)腫瘤異質(zhì)性的必然要求，也是了解腫瘤病因和制定治療決策的需要[2]。近年來出現(xiàn)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)為此類問題的解答提供了新的有利線索[3]。例如在2016年，Tirosh等[4]首次利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)剖析了轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的微環(huán)境特征；隨后在2017年，Zhang等[5]也利用該技術(shù)繪制出了第一張肝癌內(nèi)浸潤(rùn)性T細(xì)胞的免疫圖譜。然而早期的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法，多采用口吸管分離[6]或無限稀釋[7]等方法獲得單細(xì)胞，逐一進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增和文庫構(gòu)建測(cè)序，成本高，通量低。近年來微流控和分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展使單細(xì)胞分離和標(biāo)記獲得了前所未有的通量和分辨率[3，8]。2015年發(fā)表在同期《細(xì)胞》雜志上的2篇文章，介紹了dropseq和indrop兩種高通量的液滴微流控單細(xì)胞RNA測(cè)序的技術(shù)[9-10]，使單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)入了一個(gè)新階段。

在drop-seq方法中，通過正交式微流控裝置將單個(gè)細(xì)胞和單個(gè)標(biāo)記微球共包裹在1個(gè)油包水型乳濁液微滴中。通過微球上串聯(lián)攜帶的細(xì)胞特異性的條形碼（cell barcode，每個(gè)微球不同）、分子特異性的條形碼（unique molecular identifiers，UMIs，同一個(gè)微球上的每個(gè)引物分子均不同），以及捕獲mRNA用的polyT的引物序列[9]，來實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞mRNA的捕獲和標(biāo)記（如圖1）。正是得益于這種高通量的細(xì)胞包裹和分子標(biāo)記方法，我們可以一次標(biāo)記成千上萬個(gè)細(xì)胞，并對(duì)它們同時(shí)進(jìn)行測(cè)序。

圖1 液滴微流控單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)技術(shù)的原理及流程的示意圖

在本研究中，我們組裝建立了一套基于“dropseq”原理的微流控單細(xì)胞標(biāo)記系統(tǒng)，通過調(diào)節(jié)微流控的參數(shù)，獲得了最適的細(xì)胞標(biāo)記率。利用混合的人和小鼠的兩種腫瘤細(xì)胞系評(píng)價(jià)了該系統(tǒng)的精確性，表明該技術(shù)在腫瘤研究中具有廣泛的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

人急性早幼粒白血病細(xì)胞系HL-60和小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16-F10購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Gibco公司。Barcoded microparticles購自Chemgenes公司；droplet generation oil購自Bio-Rad公司；Maxima H Minus Reverse Transcriptase購自Thermo Fisher Scientific公司；十三氟-1-辛醇（Perfluorooctanol）購自Sigma公司；Exonuclease I購自NEB公司；KAPA Hifi HotStart ReadyMix購自KAPA BioSystems公司；Nextera XT DNA sample preparation kit購自Illumina公司；Ampure XP beads購自Beckman Coulter公司；BioAnalyzer High Sensitivity Chips購自Agilent公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與混合單細(xì)胞懸液制備

人急性早幼粒白血病細(xì)胞系HL-60、小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16-F10均使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d更換培養(yǎng)基。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后用40μm的細(xì)胞濾膜過濾去除細(xì)胞團(tuán)，重懸在含0.01%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中制備成單細(xì)胞懸液。將兩種單細(xì)胞懸液按照細(xì)胞數(shù)量1∶1的比例混合后，調(diào)整細(xì)胞濃度為250個(gè)/μL。

1.3 單細(xì)胞的分離和標(biāo)記

1.3.1 液滴微流控設(shè)備的組裝和運(yùn)行 液滴微流控單細(xì)胞分離系統(tǒng)主要由動(dòng)力裝置、流路裝置和控制裝置組成。系統(tǒng)的各種裝置主要由英國(guó)Dolomite公司提供。壓力泵為液體提供穩(wěn)定的動(dòng)力，流量傳感器能夠精確地監(jiān)測(cè)液體的流速。利用管路將壓力泵、流量傳感器與液滴微流控芯片緊密連接。流體控制軟件通過控制壓力泵的壓力調(diào)節(jié)流速產(chǎn)生高度均一的液滴。該系統(tǒng)還包括1個(gè)注射閥門和樣本環(huán)，用于裝載微球溶液，使微球能夠均勻地排列在管路中。

先打開空氣壓縮機(jī)和壓力泵，分別將油（droplet generation oil）和細(xì)胞裂解緩沖液[200 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5），6%聚蔗糖400溶液，0.2%十二烷基肌氨酸鈉溶液，20 mmol/L乙二胺四乙酸]放入壓力泵的液體艙中，壓力泵設(shè)置壓力為2 000 mbar，使液體充滿管路。

1.3.2 加入樣本和微球?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞與微球的包裹 將裝有單細(xì)胞懸液的1.5 mL離心管放入壓力泵的液體艙內(nèi)，打開磁力攪拌器使細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)。使用注射器向樣本環(huán)中快速加入0.5 mL微球溶液。設(shè)置細(xì)胞、微球和油的流速分別為30、30和200μL/min，按照油-細(xì)胞-微球的順序分別打開對(duì)應(yīng)的壓力泵。在芯片出口處用50 mL離心管接收產(chǎn)生的乳濁液。

1.4 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增建庫和測(cè)序

1.4.1 破裂液滴 將收集到的乳濁液去除底部多余的油，加入30 mL的6×SSC緩沖液和1 mL的十三氟-1-辛醇溶液，渦旋震蕩30 s破裂液滴。1 000 g離心1 min。將油和水界面中間的微球轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入30 mL的6×SSC溶液。1 000 g離心1 min。

1.4.2 反轉(zhuǎn)錄和酶切 按照Maxima 5×RT buffer 40 μL，20%蔗糖400溶液40 μL，dNTPs（10 mmol/L）20 μL，RNA酶抑制劑5 μL，反轉(zhuǎn)錄引物（RT primer，50 μmol/L）10 μL，Maxima H-RTase 10 μL和75 μL水，總體系200μL配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。向微球中加入反轉(zhuǎn)錄體系，37℃旋轉(zhuǎn)孵育35 min，40℃旋轉(zhuǎn)孵育90 min。再將微球分別用1 mL的TE-SDS溶液和TE-TW溶液各洗一遍。核酸外切酶反應(yīng)體系為：10×Exo I buffer 20μL，水170μL，核酸外切酶I 10 μL，總體積200μL。向微球中加入核酸外切酶反應(yīng)體系，37℃旋轉(zhuǎn)孵育40 min。

1.4.3 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化 用1 mL水重懸微球，平均每2 000個(gè)微球分裝到1個(gè)PCR管中。每個(gè)PCR管的PCR反應(yīng)體系為：水為24.6μL，PCR引物（PCR Primer，100 μmol/L）為 0.4 μL，Kapa HiFi Hotstart Readymix（2×）為25 μL，總體系50 μL，在PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94℃、3 min；97℃、20 s，66℃、45 s，74℃、3 min，共4個(gè)循環(huán)；97℃、25 s，68℃、25 s，74℃、3 min，共10個(gè)循環(huán)；74℃、5 min。 向每個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入30μL的AMPure XP beads，操作過程嚴(yán)格按照純化試劑盒說明書的要求，最終10μL的水洗脫。利用BioAnalyzer High Sensitivity Chips檢測(cè)純化樣本cDNA的質(zhì)量。

1.4.4 建庫和測(cè)序 取600 pg純化的cDNA樣本總體積5μL，加入10μL的 Nextera TD buffer和5μL的Amplicon tagment enzyme，55℃孵育5 min。再向PCR管中依次加入15μL的Nextera PCR mix，8μL的水，上、下游PCR引物（P5-PCR primer，Nextera N70X oligo，10 μmol/L）各 1 μL，在 PCR 儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95℃、30 s；95℃、10 s，55℃、30 s，共12個(gè)循環(huán)；72℃、30 s。PCR產(chǎn)物用AMPure XP beads純化。純化的cDNA產(chǎn)物用BioAnalyzer High Sensitivity Chips檢測(cè)構(gòu)建文庫的質(zhì)量。構(gòu)建的文庫利用Hiseq Xten測(cè)序平臺(tái)完成測(cè)序獲得測(cè)序原始數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

1.5.1 序列比對(duì)和生成數(shù)字表達(dá)矩陣 首先利用Picard軟件包和drop-seq工具集[9]從測(cè)序原始數(shù)據(jù)中提取出細(xì)胞標(biāo)簽（cell barcode）和分子標(biāo)簽（UMIs），并去除PCR接頭序列和polyA序列，以及測(cè)序質(zhì)量較低的序列，獲得清潔數(shù)據(jù)（clean data）。隨后使用STAR v2.4.0a軟件[11]將清潔數(shù)據(jù)與人和小鼠的基因組（hg38和mm10 reference genomes）進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而獲得每一個(gè)細(xì)胞的數(shù)字表達(dá)矩陣。

1.5.2 單細(xì)胞數(shù)字表達(dá)矩陣分析 利用R語言包Seurat[12]對(duì)單細(xì)胞數(shù)字表達(dá)譜進(jìn)行篩選，標(biāo)準(zhǔn)如下：每個(gè)合格細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到基因的數(shù)量應(yīng)≥200；每個(gè)合格的基因應(yīng)在≥4個(gè)人源細(xì)胞或≥10個(gè)鼠源細(xì)胞內(nèi)被檢出；同時(shí)，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)線粒體基因表達(dá)量在全部基因表達(dá)總量中所占比例應(yīng)≤10%。數(shù)據(jù)進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行主成分分析（PCA）[13]，t-分布領(lǐng)域嵌入算法（t-SNE）[14]亞群聚類分析，差異基因分析和亞群特異性標(biāo)志物鑒定。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 液滴微流控單細(xì)胞分離系統(tǒng)的建立

我們利用實(shí)驗(yàn)室搭建的微流控平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞的分離與標(biāo)記。正交式微流控單細(xì)胞分離芯片的設(shè)計(jì)是將兩種匯合的水路溶液快速穿過一個(gè)油通路，在水路和油路的交匯處每分鐘可以產(chǎn)生超過1×105個(gè)液滴（如圖2）。其中一條水相的通路里是含有微球的細(xì)胞裂解液（用于裂解細(xì)胞），另外兩條水相溶液是待標(biāo)記的單細(xì)胞懸液。當(dāng)一個(gè)細(xì)胞和微球包裹到同一個(gè)液滴里，細(xì)胞裂解釋放的RNA可被微球上的引物捕獲，我們認(rèn)為這個(gè)細(xì)胞后期可被測(cè)序分析（如圖1B、C）。1個(gè)細(xì)胞僅被1個(gè)微球成功包裹進(jìn)1個(gè)液滴中的概率，我們稱為細(xì)胞的標(biāo)記率。在流速一定的情況下，我們通過調(diào)節(jié)微球和細(xì)胞的濃度，以期提高細(xì)胞的標(biāo)記率，降低單細(xì)胞測(cè)序的錯(cuò)誤率。

圖2 液滴微流控單細(xì)胞分離系統(tǒng)的建立

2.2 微球的捕獲率和單細(xì)胞標(biāo)記率的調(diào)節(jié)

為了確定最適的微球濃度，我們?cè)O(shè)置油、細(xì)胞和微球的流速分別為200、30和30μL/min，觀察在不同的微球濃度（250～650個(gè)/μL）下含有單個(gè)微球的液滴占所有液滴的比例即微球的捕獲率。結(jié)果表明，隨著微球濃度的增加，微球的捕獲率增加（如圖3A），但同時(shí)兩個(gè)微球進(jìn)入同一個(gè)液滴的比例也增加，而且還出現(xiàn)堵塞芯片的現(xiàn)象。綜合多因素考慮，我們認(rèn)為微球的最適濃度為400個(gè)/μL，此時(shí)微球的捕獲率為（11.87±3.75）%（如圖3B）。從概率學(xué)的角度分析，細(xì)胞的標(biāo)記率在數(shù)值上等于含有微球的液滴占所有液滴的比例即微球的捕獲率。所以，當(dāng)微球濃度為400個(gè)/μL，細(xì)胞濃度為250個(gè)/μL時(shí)，細(xì)胞的標(biāo)記率約為11%。

2.3 模擬樣本測(cè)序結(jié)果的分析

我們以混合的人和小鼠的細(xì)胞為模擬樣品，評(píng)價(jià)液滴微流控單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)平臺(tái)所獲得的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。向單細(xì)胞分離系統(tǒng)輸入人和鼠混合的細(xì)胞7.5萬，在理論細(xì)胞標(biāo)記率為11%時(shí)，可獲得7 535個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，其中小鼠的細(xì)胞5 935個(gè)，人的細(xì)胞1 530個(gè)。人和鼠轉(zhuǎn)錄組混合的細(xì)胞有70個(gè)，僅占全部細(xì)胞的0.9%（如圖4A）。HL-60細(xì)胞平均檢測(cè)到432條轉(zhuǎn)錄本，345個(gè)基因；B16-F10細(xì)胞平均檢測(cè)到897條轉(zhuǎn)錄本，651個(gè)基因（如圖4B、C）。結(jié)果表明，我們建立的液滴微流控單細(xì)胞檢測(cè)平臺(tái)能夠獲得單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，而且檢測(cè)結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性。

2.4 微流控單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)技術(shù)能夠辨別不同的腫瘤細(xì)胞種類

我們進(jìn)一步分析了7 535個(gè)單細(xì)胞基因表達(dá)譜的特征（見圖5）。t-分布領(lǐng)域嵌入算法（t-SNE）聚類分析結(jié)果顯示，根據(jù)細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異，所有的細(xì)胞主要分為兩個(gè)細(xì)胞群（細(xì)胞群1和細(xì)胞群2），與已知的細(xì)胞種類基本一致（圖5A）。

圖3 微球濃度對(duì)含有單個(gè)微球液滴比例的影響

圖4 混合的人和鼠細(xì)胞樣本轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的初步分析結(jié)果

圖5 腫瘤細(xì)胞非監(jiān)督聚類和分析結(jié)果

我們又篩選了在2個(gè)細(xì)胞群特異性高表達(dá)的基因，在細(xì)胞群1中特異性高表達(dá)的基因前5位是NEDD4、FTH1、VIM、TPM1和ACTB，在細(xì)胞群2中特異性高表達(dá)的基因前5位是NUCB2、TMSB4X、UBA52、B2M和RPS6（如圖5B）。隨后我們用數(shù)據(jù)庫證明了這些特異性表達(dá)的基因分別在黑色素瘤細(xì)胞和粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中均高表達(dá)。以上結(jié)果證明我們獲得的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)能夠篩選出每類細(xì)胞的特異性表達(dá)標(biāo)志物。

3 討論

近年來，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)取得了快速發(fā)展，而目前最受關(guān)注的方法是微流控單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，因?yàn)樵摷夹g(shù)可以方便地捕獲和處理細(xì)胞，減少了勞動(dòng)力和實(shí)驗(yàn)成本，同時(shí)提高了數(shù)據(jù)的一致性[15]。但是，目前微流控單細(xì)胞分離的過程中仍然存在許多因素影響單細(xì)胞測(cè)序的結(jié)果，例如當(dāng)2個(gè)細(xì)胞與1個(gè)微球同時(shí)包裹到1個(gè)液滴中時(shí)，則會(huì)出現(xiàn)混合有2個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，這將可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞類型識(shí)別錯(cuò)誤，在單細(xì)胞分離的過程中要避免。類似的，當(dāng)2個(gè)微球與1個(gè)細(xì)胞同時(shí)包裹到1個(gè)液滴中時(shí)，這1個(gè)細(xì)胞則會(huì)在數(shù)據(jù)上被識(shí)別為2個(gè)細(xì)胞，從而可能在估計(jì)細(xì)胞數(shù)目時(shí)產(chǎn)生一定的偏差。因此，微流控單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的優(yōu)化和發(fā)展仍然是重要的研究方向。

到目前為止，利用drop-seq方法發(fā)表的單細(xì)胞測(cè)序的文章有十多篇，單細(xì)胞測(cè)序的焦點(diǎn)主要在胚胎發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)的研究[16-19]，而在腫瘤中的應(yīng)用相對(duì)較少。近期也有文章報(bào)道：利用drop-seq方法，輸入的所有細(xì)胞只有5%或更少的細(xì)胞能夠被測(cè)序[20]。在本研究中，我們組裝建立了一套基于“drop-seq”原理的液滴微流控單細(xì)胞分離系統(tǒng)，提高了整體系統(tǒng)的穩(wěn)定性，并通過調(diào)節(jié)微球的濃度，達(dá)到了理想的細(xì)胞標(biāo)記率，同時(shí)降低了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的錯(cuò)誤率。

為了分析我們建立的微流控單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，我們用混合的人白血病細(xì)胞（HL-60細(xì)胞）和小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16-F10細(xì)胞）進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，分析了每個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中人和小鼠基因組的讀取比例。我們的結(jié)果顯示，人和鼠轉(zhuǎn)錄組混合細(xì)胞僅占全部細(xì)胞的0.9%，表明了我們的單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果具有較高的保真度。然而，我們也注意到，本研究中每一個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量與其他文章報(bào)道的結(jié)果相比要少[9-10，22]。可能原因是我們檢測(cè)到的總細(xì)胞數(shù)目較多，在數(shù)據(jù)量一定的情況下，平均每個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)量就會(huì)減少。后期的實(shí)驗(yàn)我們可以減少每次上樣的細(xì)胞數(shù)量，增加測(cè)序的數(shù)據(jù)量。同時(shí)，我們也注意到在測(cè)序的結(jié)果中，小鼠和人的細(xì)胞數(shù)量上存在差異。這可能與細(xì)胞的大小和生長(zhǎng)方式有關(guān)，但仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

與目前已經(jīng)面世的商品化單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組標(biāo)記和建庫平臺(tái)（如10×Genomics公司的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)[21]相比，我們建立的液滴微流控單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)平臺(tái)具有模塊化、靈活度高，以及成本相對(duì)較低的優(yōu)點(diǎn)。而也恰恰因?yàn)樵撓到y(tǒng)的靈活度高，必然會(huì)增加對(duì)操作人員的培訓(xùn)難度；同時(shí)相對(duì)于商品化平臺(tái)的整機(jī)包裹，該平臺(tái)整個(gè)微流控系統(tǒng)幾乎全部裸露在外，因此對(duì)于外部環(huán)境的清潔度、桌面穩(wěn)定性等要求都比較高。盡管如此，考慮到高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究的巨大前景，我們?nèi)哉J(rèn)為將來該平臺(tái)在腫瘤細(xì)胞亞群的分析和腫瘤標(biāo)志物的篩選方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，我們建立了一套液滴微流控單細(xì)胞標(biāo)記系統(tǒng)，通過調(diào)節(jié)微球的濃度，獲得了最適的細(xì)胞標(biāo)記率，為drop-seq單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的完善提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)，也為腫瘤單細(xì)胞測(cè)序的研究提供了新的方法。