暢鴿 劉俊果

(1 華中科技大學同濟醫(yī)學院，武漢 430030；2 河北科技大學生物科學與工程學院，石家莊 050018)

截短側耳素(pleuromutilin)是一種三環(huán)二萜類抗生素，能夠有效抑制大部分革蘭陽性菌以及部分革蘭陰性菌，同時也是大量截短側耳素類半合成衍生物(如泰妙菌素、沃尼妙林)的前體[1]。臨床上作為獸用抗生素廣泛使用[2]。截短側耳素類抗生素具有獨特的抗菌機制，其與細菌的核糖體50S亞單位上的獨特位點相結合，阻斷核糖體P區(qū)域，干擾肽酰轉移酶活性，從而選擇性地抑制細菌蛋白的合成。截短側耳素類抗菌藥物在體外與其他抗菌藥物(大環(huán)內酯類、莫匹羅星或夫西地酸等)不發(fā)生靶特異的交叉耐藥(target-specific cross resistance)[3]。

近年來，隨著臨床病菌耐藥性的不斷增強，截短側耳素類抗生素由于其抑菌機制與臨床上的其他抗生素顯著不同，因此其作為人用藥制劑的開發(fā)也日益受到重視[4-5]。半合成抗生素瑞他莫林是第一個(2007年)獲準用于人類的截短側耳素類抗菌藥物[6]。

截短側耳素目前利用微生物發(fā)酵法生產[7]，分子式為C22H34O5，相對分子量為378.51，結構式如圖1。熔點為167～168℃。晶體呈乳白色，在酒精、丙酮、氯仿以及乙醚中易溶，在水中微溶，不溶于正己烷。具有較好的化學穩(wěn)定性[8]。

發(fā)酵結束后，截短側耳素主要存在于菌絲體內部，胞內產物達90%以上[10]，目前主流的提取工藝過程主要為：板框過濾→干燥→有機溶劑浸提→溶劑蒸發(fā)得到粗品→石油醚脫脂→有機溶劑溶解→活性炭脫色→冷卻結晶[11]。盡管截短側耳素具有的抗菌活性，但其由于其水溶性差等問題長期制約著該類藥物在臨床上的開發(fā)利用。

文獻中有關截短側耳素溶解度研究的報道極為有限，遠不能滿足技術與工藝開發(fā)的需求。本文通過對截短側耳素在不同溶劑環(huán)境(甲醇和乙醇在不同濃度不同溫度下)中溶解度的測定與數據分析，為優(yōu)化截短側耳素的提取工藝以及制劑提供基礎理論數據支持，同時也為截短側耳素各種制劑的開發(fā)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

圖1 截短側耳素結構式[4]Fig.1 Moecular structure of pleuromutilin

截短側耳素，純度97.2%，浙江升華拜克生物股份有限公司提供。甲醇、乙醇均為分析純，天津市永大化學試劑開發(fā)中心提供，水為實驗室自制去離子水。試驗儀器：電熱恒溫水浴箱，DK-98-11， 天津市泰斯特儀器有限公司生產。MA30水份測定儀，Sartorius公司生產。分析天平AR1140以及XPE分析天平，Mettler-tolodo儀器(上海)有限公司?？焖倩靹蚱?SK-1)，金壇市富華電器有限公司。

1.2 實驗方法

采用平衡法測定溶解度。將甲醇、乙醇用水配制成10%～50%(體積分數)的溶液，加入截短側耳素，恒溫水浴箱內保溫3h，使截短側耳素充分的溶解。期間每20min震蕩1次，若截短側耳素全部溶解，繼續(xù)加入適量截短側耳素，直到不溶為止。預實驗數據說明，保溫3h可以保證溶解過程達到平衡。上清液即為達到溶解平衡的飽和溶液。用移液器取上層清液加入到水份測定儀MA30中，分別記錄蒸發(fā)前后的質量，根據重量法計算截短側耳素的溶解度。試驗完后，調整水浴鍋到其他溫度，重復上述試驗步驟。針對溶解度在1mg/g以下的樣品，實驗的取液量約100克。每組實驗重復3次，相對誤差不高于5%，取3次實驗的平均值作為溶解度測量結果。按下式計算摩爾分數溶解度：

式中，m1、m2和m3分別代表截短側耳素、溶劑(甲醇或乙醇)的質量、水的質量，M1、M2和M3分別代表截短側耳素、溶劑(甲醇或乙醇)的摩爾質量、水的摩爾質量。x1代表截短側耳素在整個體系中的摩爾分數，x2代表溶劑(甲醇或乙醇)在溶劑體系中的摩爾分數。

2 結果與討論

2.1 截短側耳素溶解度數據測定結果

本論文測定了對截短側耳素在體積分數為0、10%、20%、30%、40%和50%甲醇溶液中分別在0、10、20、30、40和50℃下的溶解度和截短側耳素在體積分數為0、10%、20%、30%、40%和50%的乙醇溶液中分別在0、10、20、30、40、50和60℃下的溶解度，結果分別見表1～2以及圖1～2。經過誤差傳遞計算。表1～2中，摩爾分數溶解度的相對誤差不超過0.2%。由這些圖表可以看出，隨著溫度的提高，隨溶劑中甲醇或乙醇含量的增加，截短側耳素的溶解度顯著同步增加。截短側耳素在不同乙醇-水復合溶劑中的溶解度總體上比在甲醇-水復合溶劑中的溶解度高。

2.2 截短側耳素溶解度數據的關聯(lián)

2.2.1 多項式經驗方程關聯(lián)

在溶劑、溶質和壓力等因素不變時，物質溶解度由溫度決定，假設溶解度是隨溫度連續(xù)變化的，則溶解度是可以用溫度的多項式方程來表示[12]：

公式中，x1為截短側耳素的摩爾分數溶解度，T為絕對溫度K，B0、B1、B2和B3則是多項式經驗方程系數。將所測得的截短側耳素溶解度數據采用上式進行關聯(lián)，得到的多項式經驗方程中的參數值見表3。

由表3可以看出，多項式經驗方程很好的擬合了截短側耳素溶解度數據，回歸系數都在0.994以上，因此可以認為得到的這些回歸方程可以用于估計截短側耳素溶解度在不同溫度下溶解度。

2.2.2 Apelblat

方程關聯(lián)Abelblat等假定溶液的焓變?yōu)闇囟鹊木€性函數方程，進而推導出摩爾分數溶解度和絕對溫度之間存在下述關系[13-15]：

表1 截短側耳素在不同甲醇-水復合溶劑中的摩爾分數溶解度(104 x1)Tab. 1 Solubilties of pleuromutilin in binary solvents of methanol-water(104 x1)

表2 截短側耳素在不同乙醇-水復合溶劑中的摩爾分數溶解度(104 x1)Tab. 2 Solubilties of pleuromutilin in binary solvents of ethanol-water (104 x1)

圖2 截短側耳素在不同甲醇-水復合溶劑中的溶解度Fig.2 Solubilties of pleuromutilin in binary solvents of methanol-water

圖3 截短側耳素在不同乙醇-水復合溶劑中的溶解度Fig.3 Solubilties of pleuromutilin in binary solvents of ethanol-water

表3 截短側耳素溶解度多項式經驗方程關聯(lián)結果Tab. 3 Parameters of general single model for pleuromutilin in binary solvents of methanol-water and ethanol-water

公式中，x1為截短側耳素的摩爾分數溶解度，T為絕對溫度K，A、B、C則是方程經驗系數。將所測得的截短側耳素溶解度數據采用Abelblat方程進行關聯(lián)，得到的方程中的參數值見表4。

由表4的結果可以看出，Apelblat方程也很好的擬合了截短側耳素溶解度數據，回歸系數都在0.993以上，因此可以認為得到的這些Apelblat回歸方程可以用于估計截短側耳素溶解度在不同溫度下溶解度。

2.2.3 截短側耳素溶解過程熱力學參數計算

根據范特霍夫方程，對真溶液來說，某物質摩爾分數溶解度的自然對數與絕對溫度的倒數呈線性關系[16-17]，式中，ΔHF、ΔSF分別是溶解過程的表觀摩爾焓變和摩爾熵變，R是氣體常數，T為絕對溫度K：

據此，截短側耳素溶解度的自然對數對1/T進行回歸，回歸直線(回歸系數都在0.98以上)分別見圖4～5。因此，ΔHF、ΔSF可以根據直線的斜率與截距計算出來，結果見表5。由表5可以看出，截短側耳素在甲醇(或乙醇)-水復合溶劑中的溶解過程焓變都是正值，且隨著溶劑中醇含量的增加而增加。溶解過程的熵變在純水中是負值，隨著溶劑中醇含量的增加，熵變也隨之增加。這些結果說明，截短側耳素在甲醇(或乙醇)-水復合溶劑中的溶解過程是一吸熱過程，隨溶劑中不斷增加的熵變成為溶解度大幅提升的主要驅動力。

表4 截短側耳素溶解度Abelblat方程關聯(lián)結果Tab. 4 Parameters of Apelblat equation for pleuromutilin in binary solvents of methanol-water and ethanol-water

圖4 截短側耳素在甲醇-水復合溶劑中的溶解度范特霍夫方程線性回歸結果圖Fig.4 Avan't Hoff plot of mole fraction solubility (lnx1)pleuromutilin in binary solvents of methanol-water

3 結論

本研究測定了截短側耳素在不同甲醇(乙醇)-水復合溶劑中的溶解度，并采用多項式經驗方程和Apelblat方程進行關聯(lián)。結果表明，隨著溫度的提高，隨溶劑中甲醇或乙醇含量的增加，截短側耳素的溶解度顯著同步增加。截短側耳素在不同甲醇-水復合溶劑中的溶解度總體上比在甲醇-水復合溶劑中的溶解度高。同一溫度下，截短側耳素在純水中的溶解度最低。多項式經驗方程和Apelblat方程都能很好擬合截短側耳素溶解度數據，回歸系數都在0.993以上。熱力學分析表明，截短側耳素在甲醇(或乙醇)-水復合溶劑中的溶解過程焓變都是正值，且隨著溶劑中醇含量的增加而增加。溶解過程的熵變在純水中是負值，隨著溶劑中醇含量的增加，熵變也隨之增加。這些結果說明，截短側耳素在甲醇(或乙醇)-水復合溶劑中的溶解過程是一吸熱過程，隨溶劑中不斷增加的熵變成為溶解度大幅提升的主要驅動力。本研究結果可為截短側耳素的提取工藝優(yōu)化及制劑工藝開發(fā)提供重要的理論支撐。

圖5 截短側耳素在乙醇-水復合溶劑中的溶解度范特霍夫方程線性回歸結果圖Fig.5 Avan't Hoff plot of mole fraction solubility (lnx1)pleuromutilin in binary solvents of ethanol-water

表5 截短側耳素溶解過程熱力學參數的計算結果Tab. 5 Thermodynamic paramters of pleuromutilin solution