李圩田 王佳雯 洪閣 毛麗娜 劉天軍,*

(1 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192；2 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

光動(dòng)力抗菌化學(xué)療法(photodynamic antimicrobial chemotherapy, PACT)[1]是一種新型的物理化學(xué)細(xì)菌滅活方法，目前已經(jīng)成為針對(duì)細(xì)菌、真菌和病毒感染特別是耐藥菌感染最有前途的新的治療方式之一[2-4]，其關(guān)鍵是光敏劑。光敏劑[5]是一類具有光吸收能力強(qiáng)、較高的三線態(tài)轉(zhuǎn)移效率，可與氧通過(guò)能量轉(zhuǎn)移作用產(chǎn)生活性氧的化合物。它可以選擇性地富集在特定的組織，在可見光或紫外光的激發(fā)下，產(chǎn)生光動(dòng)力殺傷作用，從而起到殺菌的功效。并非所有的光敏劑具有抗菌活性，只有光敏劑進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部才能通過(guò)光動(dòng)力殺菌。喹諾酮類藥物[6-8]作為抗菌藥物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，它的抗菌機(jī)制是通過(guò)選擇性地抑制細(xì)菌DNA促旋酶起到抑菌殺菌作用，然而臨床數(shù)據(jù)揭示其抗菌效果的同時(shí)其光敏毒副作用常被提及，那么喹諾酮類藥物是否真的有光敏抗菌活性？若有將會(huì)是一件好事，尤其在細(xì)菌耐藥性[9-12]的報(bào)道日益增多的今天。本文將以臨床用藥GFLX和SPFX為例探索喹諾酮類化合物的光敏抗菌活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

GFLX購(gòu)于上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；SPFX購(gòu)于源葉生物公司，以上化合物純度均≥98%；二甲基亞砜購(gòu)于Sigma(美國(guó))；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂均購(gòu)于Oxoid(英國(guó))；氯化鈉購(gòu)于天津市江天化工技術(shù)有限責(zé)任公司，肉湯培養(yǎng)基用相應(yīng)試劑由本實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2 主要儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)(SW-CJ-IFD蘇州)；激光器(7404 Intense，美國(guó))；Maisheng Dc Power Supply(MP6010D，中國(guó))；多功能酶標(biāo)儀(Thermo 3001，美國(guó))；離心機(jī)(MIRRO22，英國(guó))；Millipore 純水儀(Mili-Q Biocel，美國(guó))；細(xì)菌培養(yǎng)箱(SANY，日本)；立式高溫高壓滅菌鍋(MJ-78A 杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWY-103B，上海智誠(chéng))。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌株

本實(shí)驗(yàn)所用MRSA(臨床分離菌株)作為革蘭陽(yáng)性菌的代表，P. aeruginosa(臨床分離菌株)，E. coli(臨床分離提取)作為革蘭陰性菌的代表，均來(lái)自解放軍304醫(yī)院。

1.4 細(xì)菌的培養(yǎng)

1.4.1 液體培養(yǎng)基的配置

蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、氯化鈉5g、蒸餾水500mL攪拌溶解，經(jīng)121℃高壓滅菌30min后，在0～4℃冷暗處備用。

1.4.2 固體培養(yǎng)基配置

瓊脂粉7.5g、蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、氯化鈉5g、蒸餾水500mL攪拌溶解經(jīng)121℃高壓滅菌30min后，放冷后，在無(wú)菌超凈工作臺(tái)上，將混合溶液倒入固體培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)基大約是15～20mL，使之均勻分布，待冷卻后，將其放入冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 喹諾酮類化合物的的紫外吸光譜研究

分別移取GFLX、SPFX的母液50μL置于不同的5mL容量瓶中，各自用0.01mol/L的鹽酸溶液定容至5mL并超聲分散，分別得到相應(yīng)濃度為0.01mmol/L的GFLX、SPFX化合物待測(cè)液。各待測(cè)液室溫靜置，在波長(zhǎng)200～700nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，并選擇其合適的光照波長(zhǎng)。

1.6 照射光波長(zhǎng)的影響

光源：650nm激光器， 450nm LED，365nm LED，白光來(lái)源于日光燈。實(shí)驗(yàn)前所有光源的光功率經(jīng)過(guò)功率計(jì)核準(zhǔn)。用LB液體培養(yǎng)基，通過(guò)二倍濃度稀釋法將藥物配置成相應(yīng)梯度濃度，37℃下與菌液(106CFU/mL)在暗處孵育30min，然后用不同波長(zhǎng)的光照射(650nm、450nm、365nm，白光)，光照功率均為1.5mW，光照時(shí)間30min作為光毒組(暗毒組不進(jìn)行光照)，通過(guò)測(cè)定GFLX、SPFX化合物的MIC與MBC，評(píng)價(jià)其光動(dòng)力抗菌活性與有效工作波長(zhǎng)。

首先，在37℃無(wú)菌搖床條件下避光孵育30min，然后在相應(yīng)光照條件下光照30min(暗毒組，不進(jìn)行光照)。然后，分別吸取100μL該96孔微量測(cè)試板中不同梯度濃度藥物和細(xì)菌的混合液，將混合液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上。隨后，將LB固體培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱條件下避光孵育，24h后評(píng)估，菌落數(shù)與對(duì)照組相比明顯減少且空白組沒有菌落生長(zhǎng)為MIC,菌落個(gè)數(shù)小于等于5的為MBC。MIC、MBC的數(shù)值越小說(shuō)明藥物的抗菌活性越好。

MIC和MBC的測(cè)量方法具體如下：以GFLX為例子。首先在96孔平底板中，分別向每個(gè)孔中加入180μL不同梯度濃度的GFLX和20μL的MRSA并混合均勻?？瞻捉M為200μL的液體培養(yǎng)基，對(duì)照組為180μL的LB液體培養(yǎng)基和20μL的MRSA混合液，進(jìn)行了3組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。首先，在37℃無(wú)菌搖床條件下避光孵育30min，然后在相應(yīng)光照條件下光照30min(暗毒組，不進(jìn)行光照)。然后，分別吸取100μL該96孔微量測(cè)試板中不同梯度濃度藥物和細(xì)菌的混合液，將混合液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上。隨后，將LB固體培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱條件下避光孵育，24h后評(píng)估，菌落數(shù)與對(duì)照組相比明顯減少且空白組沒有菌落生長(zhǎng)為MIC，菌落個(gè)數(shù)小于等于5的為MBC。MIC、MBC的數(shù)值越小說(shuō)明藥物的抗菌活性越好。

1.7 SPFX、GFLX單線態(tài)氧的測(cè)定

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13-15]，喹諾酮類化合物可以產(chǎn)生多種活性氧物質(zhì)，包括1O2、O2-、OH-等其中單線態(tài)氧在人體中有非常重要的化學(xué)反應(yīng)活性。我們基于文獻(xiàn)方法[16-18]，以1,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF)作為單線態(tài)氧捕獲劑，測(cè)定了SPFX、GFLX在的單線態(tài)氧產(chǎn)生效率。

具體步驟為：(1)分別配置好0.02mmol/L DPBF和相應(yīng)藥物；(2)將配置好的藥物(100μL)和DPBF(100μL)混合，并設(shè)計(jì)兩個(gè)對(duì)照組；(3)光照單獨(dú)對(duì)DPBF的消耗影響及對(duì)藥物的影響，以及光照對(duì)DPBF與藥物混合溶劑影響；(4)檢測(cè)不同光照時(shí)間對(duì)DPBF在410nm處吸收光度值影響。

1.8 光照功率的影響

1.8.1 GFLX抗菌MIC、MBC值的能量依賴性

用LB液體培養(yǎng)基，通過(guò)二倍濃度稀釋法將藥物配置成相應(yīng)梯度濃度，37℃下與菌液(106CFU/mL)暗孵育30min，選用450nm的光，在1.5、3、4.5和6mW等不同功率下，分別光照30min，測(cè)定GFLX的MIC與MBC，評(píng)價(jià)喹諾酮類化合物的光動(dòng)力抗菌活性，選擇合適的光照功率。

1.8.2 GFLX在MIC值處不同光能量密度對(duì)MRSA的PACT作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MRSA細(xì)菌，進(jìn)行離心，并用PBS洗菌，然后重懸細(xì)菌，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其A值，直到A600=0.7，然后稀釋菌液10倍，取稀釋的菌液100μL，和配置好的GFLX溶液100μL，使得混合后藥物濃度為0.62μg/mL。37℃下，在96孔板暗孵育30min。用450nm LED燈照射，光照能量密度分別為1、2、4、6和8J/cm2，然后分別吸取不同能量密度下的藥物與菌液混合液，進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別取稀釋度為10-4、10-5、10-6和10-7的藥物與菌液的混合液，并迅速涂固體培養(yǎng)基，每個(gè)梯度下涂3塊板，37℃烘箱下培養(yǎng)，24h后菌落計(jì)數(shù)。來(lái)表征不同激光能量密度對(duì)MRSA的PACT作用。

1.9 GFLX、SPFX對(duì)3T3細(xì)胞毒性

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[19]，研究GFLX、SPFX對(duì)3T3細(xì)胞毒性是非常有意義的,因此收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3T3細(xì)胞，在DMEM(含10%的血清)培養(yǎng)液中以1×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；隨后吸出培養(yǎng)液，分別將不同濃度的GFLX和SPFX加入到每孔中，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30min。隨后將其分組進(jìn)行光毒性與暗毒性研究。光照組采用波長(zhǎng)為650nm的光(P=2.3mW、30min、4J/cm)照射96孔板30min；暗毒組在相同條件下避光30min；隨后將光毒性與暗毒性的細(xì)胞96孔板分別置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h。然后每孔中加入50μL MTT溶液(1mg/mL)，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中作用4h。除去上清液，每孔中加入DMSO溶液150μL，震蕩搖勻，通過(guò)酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度(A)值。3T3細(xì)胞存活率按以下公式計(jì)算：細(xì)胞的存活率(%)=給藥組A值/對(duì)照組的A值×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 GFLX、SPFX的紫外吸光譜研究

圖1給出了GFLX、SPFX的吸收光譜，它們?cè)?75～300nm處有很強(qiáng)的吸收峰，GFLX在374nm處也有一個(gè)較強(qiáng)的紫外吸收峰。全波長(zhǎng)光譜對(duì)GFLX、SPFX在光照波長(zhǎng)選擇上有一定的指導(dǎo)作用，因此，在“2.2”項(xiàng)中，本文探討了365、450、650nm、白光及暗毒組等不同波長(zhǎng)條件下GFLX、SPFX的抗菌活性。

2.2 GFLX、SPFX在不同波長(zhǎng)光照射下的MIC、MBC值

圖1 GFLX、SPFX紫外吸收?qǐng)D譜Fig.1 GFLX, SPFX UV absorption spectrum

由于SPFX藥物在365nm有較強(qiáng)的吸收，本研究探討了SPFX在365nm的光動(dòng)力滅菌活性，結(jié)果表明在365nm光的照下空白對(duì)照組的A600=0.4，而暗毒組的A600=0.7，說(shuō)明365nm處光照已經(jīng)具有殺菌作用。紫外光(200～400nm)可以獨(dú)立滅菌，同時(shí)對(duì)細(xì)胞也具有一定的殺傷作用，在此區(qū)間進(jìn)行研究意義不大，因此我們的研究選取可見光區(qū)，包括藍(lán)光(450nm)，紅光(650nm)以及白光(長(zhǎng)波混合光)進(jìn)行研究，盡管在此區(qū)間GFLX與SPFX的吸收光子能力較弱且相互間有差異，這會(huì)致使其光動(dòng)力抗菌活性的差異，但研究結(jié)果具有一定的借鑒意義。

本文探討了450nm、650nm和白光等不同光照條件下，SPFX、GFLX對(duì)MRSA、P. aeruginosa、E.coli的抗菌活性(表1～2)，結(jié)果表明，在光照條件下，喹諾酮的抗菌活性的確有一定程度的提高，遠(yuǎn)優(yōu)于暗毒組；且用不同波長(zhǎng)的光照射，對(duì)于同一種細(xì)菌其MIC/MBC值均有一定的差別。表1說(shuō)明GFLX在450nm的光照下其抗菌活性略優(yōu)于其它光照條件下。由于GFLX為第四代喹諾酮類抗菌藥物，為新一代抗菌喹諾酮藥物。因此，本文選擇450nm處光照條件下進(jìn)行下近一步深入研究。

2.3 GFLX、SPFX單線態(tài)氧測(cè)定

圖2表明，伴隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，光照對(duì)DPBF的影響與光照對(duì)藥物SPFX、GFLX產(chǎn)生單線態(tài)氧對(duì)DPBF的影響趨勢(shì)一樣，說(shuō)明了光照SPFX、GFLX產(chǎn)生較弱的單線態(tài)氧。這與表1～2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，即光照可以增加喹諾酮藥物的抗菌活性，但提升有限。

2.4 GFLX抗菌MIC、MBC的值的能量依賴性

表1 GFLX在不同波長(zhǎng)下的抗菌MIC、MBC的值/(μg/mL)Tab. 1 Antibacterial MIC and MBC values of GFLX at different wavelengths/(μg/mL)

表2 SPFX在不同波長(zhǎng)下的抗菌MIC、MBC的值/(μg/mL)Tab. 2 Antibacterial MIC and MBC values of SPFX at different wavelengths/(μg/mL)

圖2 DPBF作為單線態(tài)氧捕獲劑在不同溶液狀態(tài)下隨時(shí)間變化圖Fig.2 Graph of DPBF as a singlet oxygen trap over time in different solution states

表3 GFLX在450nm波長(zhǎng)下的抗菌MIC和MBC(μg/mL)Tab. 3 Antibacterial MIC and MBC of GFLX at 450nm wavelength(μg/mL)

圖3 GFLX在450 nm波長(zhǎng)下光穩(wěn)定性研究Fig.3 Photostability study of GFLX at 450nm wavelength

表3是GFLX在450nm光照射下對(duì)于3種細(xì)菌的MIC、MBC隨著光照能量的變化，結(jié)果表明隨著光照能量的增大。對(duì)于革蘭陽(yáng)性菌MRSA和革蘭陰性菌E. coli，其MIC、MBC值都有一定程度的增大，對(duì)于革蘭陰性菌P. aeruginosa，MIC值略有增加，而MBC總體減小。這與強(qiáng)光敏抗菌藥物的行為有很大差異。這種差異可能源于GFLX的濃度減少，然而圖3表明GFLX在12J/cm2以內(nèi)照射光譜變化不大，對(duì)于光照保持良好的穩(wěn)定性，并無(wú)光分解，因而藥物濃度相對(duì)穩(wěn)定。因而本文認(rèn)為MIC和MBC的反常變化源于喹諾酮類藥物弱的光敏抗菌活性以及光照引起細(xì)菌培養(yǎng)液的溫度少幅度提升帶來(lái)細(xì)菌的增殖，這進(jìn)一步表明GFLX不適合光敏抗菌用。

2.5 GFLX在MIC值處不同激光能量密度對(duì)MRSA的PACT作用結(jié)果

進(jìn)一步探究光能量密度對(duì)于細(xì)菌的菌落數(shù)量的影響，圖4說(shuō)明了能量密度由2～4J/cm2光照后，細(xì)菌存活數(shù)量迅速減少，起到了強(qiáng)烈的光動(dòng)力抗菌活性；隨著能量密度的增大，在能量密度為4J/cm2，細(xì)菌的菌落數(shù)保持一定的數(shù)量基本不在減少，這一說(shuō)明喹諾酮類藥物的光動(dòng)力滅菌效能不高，盡管臨床上這類藥物有一定的光敏毒副作用，還不足以用于臨床殺菌。

2.6 SPFX、GFLX對(duì)3T3細(xì)胞毒性

圖5的MTT結(jié)果表明，當(dāng)GFLX、SPFX藥物濃度小于20μg/mL，光照對(duì)3T3細(xì)胞沒有表現(xiàn)出明顯的毒性，且光照組與暗毒組沒有明顯的差異，而藥物的抗菌MIC、MBC值遠(yuǎn)小于20μg/mL，因此，在此條件下光動(dòng)力抗菌是安全的。

圖4 不同光照能量密度對(duì)MRSA的PACT作用Fig.4 PACT effects of different light energy densities on MRSA

圖5 GFLX、SPFX對(duì)3T3細(xì)胞毒性圖Fig.5 GFLX and SPFX to 3T3 cytotoxicity

3 結(jié)論

通過(guò)SPFX，GFLX對(duì)MRSA、P.aeruginosa、E. coli光動(dòng)力研究，對(duì)比了不同光照條件與暗毒組抗菌活性結(jié)果，得出光動(dòng)力手段可以一定程度上增加GFLX和SPFX的抗菌活性，但提升有限，在此區(qū)間其光敏毒副作用有限，這類藥物不會(huì)傷及細(xì)胞，因而喹諾酮類藥物在臨床上不足以作為光敏抗菌藥物使用，相對(duì)安全。