江金歡，張麗鴻，汪亞蘋，李奧運(yùn)，張佳露，參木有，巴桑旺堆，李家奎，2

（1．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，武漢 430070；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科技學(xué)院，林芝 860000；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院草業(yè)科學(xué)研究所，拉薩 850009；4.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，拉薩 850000）

溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica）原名溶血性巴氏桿菌，是反芻動物（牛、綿羊）肺炎、新生羔羊急性敗血癥的病原菌。本屬成員原屬于巴氏桿菌屬。

Angen 等［1］根據(jù)DNA 雜交及16S rRNA 序列分析的結(jié)果，建議建立一新屬，其代表種即為溶血性曼氏桿菌。該菌屬于條件致病菌，通常寄生于牛、羊鼻咽部等上呼吸道［2］，在受到應(yīng)激或感染病毒以后，溶血性曼氏桿菌數(shù)量增加并下行到肺部，導(dǎo)致急性肺炎［3］。根據(jù)溶血性曼氏桿菌莢膜抗原的不同，將其分為12 個莢膜血清型，其中感染牛引起發(fā)病的主要為血清1、6 型，感染羊引起發(fā)病的主要為血清2 型［1］。溶血性曼氏桿菌在美國、加拿大、澳大利亞、土耳其等多個國家均有報道，給世界牛、羊養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2-4（］NCBI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫）。我國吉林、山東、安徽、四川、重慶、云南等多個省市均有牛、羊感染溶血性曼氏桿菌導(dǎo)致死亡的情況，給養(yǎng)殖業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)損失［5-7］。

2017 年8 月，西藏山南市某地某農(nóng)戶飼養(yǎng)的綿羊出現(xiàn)大批死亡，為查明其發(fā)病原因，本研究采集了病死羊心臟、脾臟、小腸、肺臟、氣管等樣品，對病原進(jìn)行分離和鑒定，并對分離菌株的血清型和耐藥性進(jìn)行分析，以查明該病致病病菌，從而為該病的臨床診斷和防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品采集

病死綿羊心臟、脾臟、小腸、肺臟、氣管等來自西藏山南市某農(nóng)戶。

1.2 主要試劑

血瓊脂平板購自青島海博生物技術(shù)有限公司；營養(yǎng)瓊脂購自武漢科瑞生物技術(shù)有限公司；麥康凱瓊脂購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；馬丁肉湯購自青島賓得生物技術(shù)有限公司；生化反應(yīng)試劑、藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司；PCR 試劑、DNA Marker 等均購自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

無菌挑取心臟、脾臟、小腸、肺臟、氣管，接種于營養(yǎng)瓊脂和血瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取血瓊脂平板上露珠樣單菌落，轉(zhuǎn)接于血瓊脂平板純化，37 ℃培養(yǎng)24 h。再挑取血瓊脂平板上單菌落，轉(zhuǎn)接于血瓊脂平板和麥康凱瓊脂，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取血瓊脂平板上純化后的菌落，進(jìn)行瑞氏染色和革蘭氏染色鏡檢，并挑取血瓊脂平板上單菌落接種于馬丁肉湯中，于37 ℃的空氣浴水平搖床（120 r/min）進(jìn)行增菌培養(yǎng)24 h。

1.4 分離菌株的生化試驗

按照生化試劑說明書的方法，將分離株的增菌液取10 μL 接種于葡糖糖、甘露醇、甘露糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、血清菊糖、蕈糖、果糖、麥芽糖、鼠李糖生化培養(yǎng)基內(nèi)，置于37 ℃培養(yǎng)24 h 后，觀察其主要生化特性。

1.5 分離菌株16S rDNA 基因序列的擴(kuò)增與遺傳進(jìn)化分析

用水煮加冰浴的方法提取上述溶血性曼氏桿菌分離菌株的基因組DNA。采用文獻(xiàn)［7］的PCR 方法，以16S rDNA 的通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物序列為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，擴(kuò)增長度約1 500 bp。PCR 反應(yīng)體系50 μL：PCR-MIX 25 μL，ddH2O 21 μL，DNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃1 min，30 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR 產(chǎn)物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。

在NCBI 上利用BLAST 將測序確定的分離株16S rDNA 基因序列同GenBank 數(shù)據(jù)庫中收錄的親緣關(guān)系較近的細(xì)菌基因序列進(jìn)行同源性比對，并從GenBank中下載不同國家、不同宿主、不同時間同源性較高的細(xì)菌基因序列20 條，采用Mega7.0 軟件構(gòu)建該菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 分離菌株莢膜血清型的鑒定

將分離株的基因組DNA 采用Klima 等［8］建立的鑒定該菌株莢膜血清型1、2 和6 的多重PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，分別以Hyp、Core2、TupA為靶基因，引物信息見表1。PCR 反應(yīng)體系50 μL：PCR-MIX 25 μL，上下游引物3對各0.2 μM，模板DNA 2 μL，補(bǔ)充ddH2O 到50 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃15 min；94 ℃30 s，55 ℃45 s，72 ℃1 min，35 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 檢測溶血性曼氏桿菌莢膜血清型1、2 和6 的特異性引物序列

1.7 分離菌株的藥敏試驗

按照WHO 推薦的K-B 紙片法挑取分離株進(jìn)行藥敏試驗。挑取純化的單菌落接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。取100 μL，用無菌推桿均勻涂布于血瓊脂平板，放置藥敏片，37 ℃培養(yǎng)24 h。藥敏結(jié)果判定按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NC-CLS）2009 年標(biāo)準(zhǔn)記錄進(jìn)行。

1.8 臨床采集樣品中分離株的特異PCR 檢測和主要毒力基因lktA 基因檢測

將純化后的單菌落接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。取2 000 μL，用水煮加冰浴的方法進(jìn)提取。以其為模板，采用文獻(xiàn)［9］建立的特異性檢測分離株gcp基因和文獻(xiàn)［10］建立的檢測lktA毒力基因的PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，gcp引物序列為5'-TGGGCAATACGAACTACTCGGG-3'/5'-CTTTAATCGTATTCGCAG-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段為227 bp；lktA引物序列為5'-CTTACATTTTAGCCCAACGTG-3'/5'-TAAATTCGCAAGATAACGGG-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段為497 bp；引物由北京擎科新業(yè)生物有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系50 μL：PCR-MIX 25 μL，上下游引物各0.2 μM，DNA 模板2 μL，補(bǔ)充ddH2O 到50 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃30 s，40 個循環(huán)；72 ℃10 min。lktA基因PCR 反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃40 s，40 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

病料接種于營養(yǎng)瓊脂和血瓊脂平板上，于37 ℃培養(yǎng)24 h。肺臟、氣管接種的血平板長出灰白色、光滑、半透明、露珠樣小菌落（圖1），營養(yǎng)瓊脂上菌落生長貧瘠。挑取血瓊脂平板上露珠樣單菌落接種于麥康凱瓊脂，37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落未生長。挑取血瓊脂平板純化后的菌落染色鏡檢，瑞氏染色可見藍(lán)紫色的球桿菌；革蘭氏染色可見兩極著色的紅色短桿菌，菌體兩端鈍圓。菌落形態(tài)、培養(yǎng)特性、染色特性疑似溶血性曼氏桿菌菌落。

圖1 病死羊肺臟挑菌接種血平板分離菌株菌落生長形態(tài)

2.2 分離菌株的生化反應(yīng)特性

將分離菌株的增菌液接種于生化培養(yǎng)基內(nèi)，檢測其生化特性，結(jié)果顯示該菌株發(fā)酵葡萄糖、甘露糖、甘露醇、半乳糖、蔗糖、蕈糖、血清菊糖、果糖、麥芽糖，不發(fā)酵乳糖、鼠李糖。生化試驗重復(fù)3 次，結(jié)果一致（表2）。

表2 分離菌株生化特性

2.3 分離株16S rDNA 基因序列擴(kuò)增與遺傳進(jìn)化分析

以分離菌株的DNA 為模板，利用16S rDNA 的通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約1 500 bp 的位置出現(xiàn)條帶，與預(yù)期目的片段相符（圖2）；將測序結(jié)果與NCBI 上GenBank 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果顯示為溶血性曼氏桿菌。

圖2 分離菌株16S rDNA 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

將分離菌株的16S rDNA 基因序列與不同國家、不同宿主、不同時間分離株同源性高的溶血性曼氏桿菌16S rDNA 基因序列做系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，分離的溶血性曼氏桿菌與2013 年美國株牛源溶血性曼氏桿菌（CP005972.1）遺傳進(jìn)化關(guān)系最近（圖3）。進(jìn)一步證明分離株為溶血性曼氏桿菌。

2.4 溶血性曼氏桿菌分離株莢膜血清型的鑒定結(jié)果

以陽性分離株的基因組DNA 為模板，用特異性鑒定溶血性曼氏桿菌莢膜血清型1、2 和6 的PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示在約160 bp（Core2基因）處擴(kuò)增出目的條帶，證明其為莢膜血清2 型（圖4）。本試驗重復(fù)3 次，結(jié)果一致，證明分離的溶血性曼氏桿菌為莢膜血清2 型。

2.5 溶血性曼氏桿菌分離株的藥敏試驗

挑取溶血性曼氏桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果顯示，分離的溶血性曼氏桿菌對環(huán)丙沙星、四環(huán)素、頭孢呋辛、諾氟沙星、氟苯尼考、紅霉素、氨芐西林、頭孢唑林、多西環(huán)素、氯霉素、慶大霉素、新生霉素、阿奇霉素、頭孢拉定、頭孢氨芐、卡那霉素、復(fù)方新諾明等17種臨床常用抗生素敏感，對頭孢曲松、頭孢克肟、阿莫西林等3 種藥物中度敏感（表3）。

圖3 溶血性曼氏桿菌16S rDNA 基因的遺傳進(jìn)化樹

圖4 分離的溶血性曼氏桿菌莢膜血清型多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

表3 分離菌株藥敏試驗結(jié)果

2.6 溶血性曼氏桿菌分離株P(guān)CR 檢測結(jié)果

以分離菌株純化后的單菌落增菌液提取基因組DNA 為模板，利用特異性檢測溶血性曼氏桿菌gcp基因的PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示gcp基因（圖5）和lktA毒力基因（圖6）均擴(kuò)增出了目的條帶。表明引起該戶綿羊死亡的病原為溶血性曼氏桿菌。

圖5 分離的溶血性曼氏桿菌gcp 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

圖6 分離的溶血性曼氏桿菌lktA 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

本研究在西藏成功分離了溶血性曼氏桿菌，分離株普通瓊脂生長貧瘠，基本不生長；血瓊脂平板生長良好，菌落特性與溶血性曼氏桿菌菌落特性符合。染色特性為革蘭氏陰性兩極著色短桿菌，瑞氏染色為藍(lán)紫色球桿菌，與溶血性曼氏桿菌相符。生化特性與文獻(xiàn)［1］記載基本相同，不同之處為文獻(xiàn)［1］記載，該菌不發(fā)酵菊糖和甘露糖，但本試驗分離菌株發(fā)酵這兩種糖類。分析原因可能為該菌分離自高原動物，在氧氣稀薄、氣候惡劣的環(huán)境下，在綿羊體內(nèi)遺傳進(jìn)化過程中調(diào)控某些生化特性的基因發(fā)生改變。

目前，GenBank 中登錄國內(nèi)的溶血性曼氏桿菌16S rDNA 基因序列僅有9 條。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，該試驗分離的溶血性曼氏桿菌與美國羊源溶血性曼氏桿菌菌株聚為一支，表明分離株與美國羊源菌株遺傳進(jìn)化關(guān)系較近。gcp基因特異性檢測溶血性曼氏桿菌為Shanthalingam 等［9］建立的方法，本試驗使用該方法準(zhǔn)確檢測出了分離株，具有較好的特異性。而lktA基因為溶血性曼氏桿菌的毒力基因，并未存在于所有溶血性曼氏桿菌中，溶血性曼氏桿菌的致病性與該基因有關(guān)［9］。本試驗采用Bavananthasivam 等［10］檢測lktA基因的方法檢測出分離株存在該基因，以往研究認(rèn)為該基因與溶血性曼氏桿菌的β-溶血有關(guān)，但Bavananthasivam等研究認(rèn)為，β-溶血可能不是溶血性曼氏桿菌分離株白細(xì)胞毒性的可靠指標(biāo)。本試驗分離株具有l(wèi)ktA基因，但溶血性試驗發(fā)現(xiàn)該菌為γ-溶血，即未見溶血環(huán)。

溶血性曼氏桿菌已經(jīng)確定的血清型為12 個，血清型1、2 和6 在不同宿主間流行較為廣泛，也是引起綿羊肺炎較常見血清型［11-12］。不同血清型毒力差別較大，在美國，約60%的病例可分離到6 型菌株［1］。Klima 等［8］建立的檢測血清1、2 和6 的多重PCR 方法操作簡便，較傳統(tǒng)凝集試驗節(jié)省時間和人力。本試驗采用該方法簡便、迅速地測出分離株為血清2 型。國內(nèi)對綿羊溶血性曼氏桿菌血清型流行病學(xué)調(diào)查較少，而不同血清型毒力差別較大，所以血清型鑒定和流行病學(xué)調(diào)查對診斷、預(yù)防和治療該疾病均有重要意義。

抗生素是治療細(xì)菌性疾病的主要措施，了解分離株對臨床常用抗生素的敏感性有利于在臨床爆發(fā)溶血性曼氏桿菌疾病時指導(dǎo)用藥。據(jù)文獻(xiàn)記載，該菌在國內(nèi)外均有報道耐藥菌株的出現(xiàn)，其中國外以替米考星、土霉素、氟苯尼考、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、阿莫西林居多［13］，國內(nèi)以氨芐西林、苯唑西林、頭孢氨芐、先鋒噻肟、頭孢噻吩、頭孢呋肟為主［14］。為了篩選出該分離株敏感性藥物，本研究采用20 種抗生素對分離株進(jìn)行藥物敏感性試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該分離株對大多數(shù)臨床常用抗生素均表現(xiàn)敏感或中度敏感，無耐藥菌株出現(xiàn)，與文獻(xiàn)［6］記載一致。雖然本試驗分離的溶血性曼氏桿菌對臨床常用抗生素未表現(xiàn)出耐藥性，但國內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)耐藥菌株。其中四川、吉林、安徽、重慶均分離出耐藥菌株［5，14］，以重慶肉牛溶血性曼氏桿菌分離株尤為明顯，對卡那霉素、鏈霉素、頭孢呋肟、慶大霉素、先鋒噻肟、頭孢噻吩、頭孢氨芐、苯咗青霉素、羅紅霉素、羧芐青霉素、洛美沙星、氨芐青霉素、青霉素G 等多種臨床常用抗生素表現(xiàn)耐藥性［7］。本研究結(jié)果進(jìn)一步說明了不同地區(qū)分離菌株的耐藥性存在差異，同時表明該地區(qū)抗生素濫用情況較少。研究結(jié)果對該地區(qū)治療綿羊感染溶血性曼氏桿菌用藥提供了參考。