張 帥，曲永利，李 偉，辛小月，王 璐，殷術鑫

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319）

目前，抗生素已成為奶牛肺炎、乳房炎、子宮炎和其他疾病的最經濟有效的治療藥物［1-3］。但是在用藥期間以及停藥期，奶中會含有抗生素，這種含有抗生素、高體細胞數的奶統(tǒng)稱為抗奶，被用作犢牛的具有成本效益的飼料［4］。瘤胃中眾多微生物具有多重耐藥性和廣譜抗性［5］。Smillie 等［6］觀察到42 種常見的抗生素抗性基因（ARGs）以及43 種能夠跨地域的ARGs。世界衛(wèi)生組織公布的12 種耐藥細菌中半數為β-內酰胺類抗生素［7］。因此，探討飼喂β-內酰胺類抗奶對犢牛瘤胃菌群基因功能的影響具有重要意義。目前，許多高通量測序技術已被用于反芻動物瘤胃微生物方面的研究，如Pandya 等［8］研究了3 頭成年蘇替水牛的瘤胃細菌菌群，區(qū)分出42 個可操作的分類單位；Jami 等［9］通過焦磷酸測序研究了16 頭泌乳奶牛瘤胃中的細菌種群，不同樣品在細菌分類群中顯示出51%的相似性。盡管目前對反芻動物瘤胃菌群的研究較多，但是瘤胃菌群與抗奶的關系，特別是抗奶與瘤胃菌群基因功能之間的關系尚不清楚。本試驗旨在對飼喂抗奶的犢牛進行瘤胃菌群基因功能注釋、豐度分析和差異分析，為國內外奶牛養(yǎng)殖場使用抗奶提供合理可靠的科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

本試驗于黑龍江省大慶市某大型規(guī)?；翀鲞M行，按照出生日齡相近的原則，選取45 頭3 日齡左右、體重40 kg±5 kg 的健康荷斯坦犢牛，采用完全隨機試驗設計，隨機分為3 組，即巴氏消毒抗奶組（B1）、抗奶組（B2）和無抗鮮奶組（B3），每組15 頭。試驗期共180 d，其中哺乳期60 d。

1.2 試驗日糧

試驗用無抗鮮奶采自健康泌乳奶牛，抗奶采自使用β-內酰胺類抗生素（頭孢噻呋鈉）治療的處于治療期或停藥期的泌乳奶牛，巴氏消毒抗奶為使用巴氏消毒機械將β-內酰胺類抗奶置72～75 ℃下滅菌15 s 所產生的奶。試驗日糧由顆粒料（開食料）和優(yōu)質羊草組成，均采用CPM 軟件將日糧配方優(yōu)化形成，試驗日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質基礎）%

1.3 飼養(yǎng)管理

每頭犢牛出生半小時內飼喂初乳4 kg；2～3 日齡飼喂過渡乳，試驗期間B1、B2 和B3 三組的飼喂量4～7 日齡每頭5 kg/d，日飼喂3 次；8～20 日齡每頭5.5 kg/d，日飼喂3 次；21～40 日齡每頭4 kg/d，日飼喂2 次；41～50日齡每頭3 kg/d，日飼喂2 次；51～60 日齡每頭1 kg/d，日飼喂1 次。各組犢牛于8 日齡時開始添加優(yōu)質羊草和顆粒料，8～20 日齡每頭添加量0.3 kg/d；21～40 日齡每頭添加量0.6 kg/d；41～50 日齡每頭添加量0.8 kg/d；51～60 日齡每頭添加量1.0 kg/d，并保證充足清潔飲水。飼養(yǎng)期間3 組犢牛除了飼喂奶源不同，其他飼養(yǎng)管理均相同。犢牛舍內衛(wèi)生按照牛場日常生產管理要求進行清掃。

1.4 樣品的采集

巴氏消毒抗奶組（B1）、抗奶組（B2）、無抗鮮奶組（B3）3 組犢牛于60（T1）、90（T2）和180 日齡（T3）時各選取6 頭，采用穿刺方法采集瘤胃液，分別將3 組犢牛不同日齡瘤胃液過濾后混合，共9 個樣品，于液氮冷凍保存，構建犢牛瘤胃細菌宏基因組文庫。試驗分組與瘤胃液編號見表2。

表2 試驗分組與編號

1.5 細菌基因組DNA 提取、測序與生物信息學分析

根據細菌基因組DNA 快速提取試劑盒（#55-20201，SinoGene）的要求，對瘤胃液宏基因組DNA 進行分離。測序文庫根據文庫制備試劑盒（New England Biolabs，Inc，Beverly，MA，USA）的制造商說明構建。此外，通過Illumina NextSeq 500 測序平臺在文庫上進行雙末端測序。

測序完成后統(tǒng)計原始數據，對不小于300 bp 的contigs 進行篩選和測序，利用MetaGeneMark 軟件進行基因預測OFR，以CD-HIT 軟件選出最長的序列為代表性序列，并得到每個樣品中各代表性基因的豐度。由每個樣品中基因提取的contigs 在各樣品中的單堿基位點深度數據出發(fā)，根據基因在Scaftigs 上的起始位點和終止位點，可以得到各樣品中各代表性基因的豐度。通過與eggNOG 數據庫（Evolutionary genealogy of genes：Non-supervised Orthologous Groups，http：//eggn og.embl.de/version_3.0/）比對，上傳序列用KAAS 軟件進行KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）注釋，并與CAZy 數據 庫（Carbohydrate-Active Enzymes Database，http：//www.cazy.org/）比對，注釋得到各樣品的基因豐度情況。根據FC1 與p0.05 的表達量，對所有基因進行注釋整理后得到的差異表達基因，用R 軟件進行差異豐度分析和聚類分析。分析瘤胃細菌的抗生素抗性基因，利用生物信息學分析其基因序列、結構及表達產物。本研究基于國際抗生素耐藥基因數據庫（ARDB）進行分析和注釋。

2 結果與分析

2.1 eggNOG 功能基因注釋

如圖1 所示，eggNOG 分析涉及到86 145 個基因，并獲得了相應的功能注釋，根據功能，基因可分為23類，主要分布在一般功能基因（R，10 519 條），占9.69%；翻譯、核糖體結構和合成（J，9 984 條），占9.19%；復制重組與修復（L，8 335 條），占7.68%；細胞壁/膜/包被的形成（M，7 582 條），占6.98 %；氨基酸轉運和代謝（E，7 269 條），占6.69%；糖類轉運和代謝（G，6 353 條），占5.85%；能量產生與轉換（C，5 082 條），占4.68%；轉錄（K，4 677 條），占4.31%；核苷酸轉運與代謝（F，4 294 條），占3.95%；其他為未知基因功能（S，22 050 條），占20.3%。

圖1 NOG 注釋圖

2.2 KEGG 分析結果

使用KASS 軟件對上傳的基因序列進行KEGG 注釋，注釋到43 條通路，得到6 種類型的統(tǒng)計注釋結果，其中包括細胞過程（Cellular processes）、環(huán)境信息處理（Environmental information processing）、 新 陳 代 謝（Metabolism）、人類疾?。℉uman diseases）、遺傳信息處理（Genetic information processing）和生物體系統(tǒng)（Organismal systems），每種類型的信號通路不同。在這6 類通路中，人類疾病、環(huán)境信息處理、新陳代謝和遺傳信息處理是其中主要富集途徑，見圖2。由圖2 可知，通過KEGG pathway 富集分析了1 905 條基因，富集通路在環(huán)境信息處理中主要是膜轉運（Membrane transport，298條，占8.0%）和信號傳導（Signal transduction，277 條，占7.43%）的相互作用；在遺傳信息處理方面主要是翻譯（Translation，255 條，占6.84%）；人類疾病方面以傳染?。↖nfectious disease，345 條，占9.26%）為主；新陳代謝中通路富集在糖代謝（Carbohydrate metabolism，251 條，占6.73%）、輔助因子和維生素代謝（Metabolism of cofactors and vitamins，225 條，占6.04%）以及氨基酸代謝（Amino acid metabolism，254 條，占4.31%）等方面。

2.3 碳水化合物活性酶注釋

通過HMMER3 分析，在CAZy 數據庫中比對發(fā)現有33 980 條基因，注釋統(tǒng)計結果如圖3 所示，主要包括9 大功能：糖苷水解酶類（Glycosyl hydrolases，GH，12 349條，數量最多）、糖基轉移酶類（Glycosyl transferases，GT，9 210 條）、碳水化合物結合模塊（Carbohydrate binding modules，CBM，6 491 條）、碳水化合物酯酶類（Carbohydrate esterases，CE，4 156 條）、多糖裂合酶（Polysaccharide lyases，PL，723 條）和輔助氧化還原酶類（Auxiliary activity，AA，356 條）。此外，還發(fā)現了71 條黏連蛋白（Cohesin）、526 條對接蛋白（Dockerin）以及98 條S 層蛋白同源（S-layer homology，SLH）。根據不同樣品間的9種功能酶占的比例得出，不同樣品9 種功能酶的比例差異不顯著，GH基因所占比例最大，其次分別是GT、CBM、CE 等。

圖2 KEGG 注釋圖

圖3 CAZy 數據庫注釋圖

2.4 分級注釋豐度差異分析

由表3 可知，在3 個數據庫中，T1-T3 組樣品注釋到的豐度差異均最高，B2-B3 組和B1-B2 組在KEGG和NOG 數據庫中分別也有較高的細菌菌群豐度差異。

表3 分級注釋豐度差異性分析

2.5 不同組間KEGG 功能比較

在整個代謝通路圖上對多個樣本進行比較，可以發(fā)現在整個代謝通路中不同組間有差異以及在實際環(huán)境中不同群落發(fā)揮不同作用的通路，見圖4。從圖4 中可以看出，在9 個樣本中進行分級注釋得到KO terms，隨著犢牛月齡的增加，相對豐度有明顯變化。60 日齡與90 日齡、180 日齡的犢牛瘤胃基因代謝通路的KO terms 相對豐度差異顯著（P<0.005），90 日齡與180 日齡之間差異較小。飼喂不同奶源對犢牛瘤胃代謝通路的KO terms 相對豐度無明顯影響，其中60 日齡犢牛瘤胃基因參與的代謝term 豐度差異最小（58，69，70）；而到90 日齡，抗奶組犢牛瘤胃基因參與代謝term 豐度與無抗鮮奶和巴氏消毒抗奶組的犢牛顯著不同；到180 日齡，無抗鮮奶組犢牛瘤胃基因參與的代謝term 豐度與其他兩組略有不同。

圖4 多組間KEGG 聚類分析

2.6 差異基因的代謝通路分析

在T1-T2、T1-T3 兩組中差異表達基因（DEGs）分別有318 個和1 398 個，顯著富集代謝通路分別為9 個和33 個，包括2 個常見的細胞周期通路，見圖5，其中包括糖原合成酶激酶-3（GSK-3β）、周期蛋白依賴性激酶2 基因（CDK2）、周期蛋白依賴性激酶7 基因（CDK7）和氨基酸合成代謝通路（見圖6）富集。B1-B2 組和B1-B3 組DEGs 分別有30 個和24 個，分別在9 個和1 個代謝通路中明顯富集，然而兩組在比較中沒有發(fā)現DEGs富集在共同的代謝通路。

圖5 細胞周期通路圖

2.7 抗性基因種類和產生機制

本試驗檢測了9 個犢牛瘤胃液樣品中ARGs的基因型及相對含量，結果見圖7，共發(fā)現19 種基因型，分為6 類，其中氨基糖苷類抗生素抗性基因型5 種，包括aphbid、aPhiiia、aph33ib、antbia和accbie；大環(huán)內酯類抗生素抗性基因型5 種，包括ermb、ermf、ermg、ermq和mema；四環(huán)素類抗生素抗性基因型5 種，包括tet37、tet32、teto、tetw和tetx；β-內酰胺類抗生素抗性基因型2種，為bl2b_rob和bl2e_cfxa；磺胺類抗生素抗性基因型sul2，桿菌肽類抗生素抗性基因型baca。對抗生素耐藥性產生機制作進一步分析（見圖8），其中在抗生素耐藥性產生機制中占最大比例是由外排泵引起的（Efflux pump，56.57%）；然后依次是抗生素失活（Antibiotic deactivation，26.26%）、細胞保護（Cellular protection，12.64%）與其他/未知（Other/unknow，4.53%）。

圖6 氨基酸生物合成路徑圖

圖7 抗性基因的基因型及相對含量

圖8 抗性基因產生機制比例圖

3 討論

反芻動物瘤胃中的微生物菌群有助于宿主消化自身不能消化的植物物質，為機體提供營養(yǎng)和能量，還可與宿主互作并影響宿主的健康、生產性能等［11］。然而反芻動物日齡的增長會影響瘤胃內微生物的組成［12］。Jami［9］等認為瘤胃菌群受日糧和動物日齡的共同作用。在本研究中，隨著犢牛日齡的增長，瘤胃細菌菌群豐度有增加趨勢，這與前人研究結果一致。說明瘤胃微生物區(qū)系隨著日齡的增加有改善的趨勢，增加了營養(yǎng)物質的表觀消化率［13］。

β-內酰胺類抗生素具有廣譜的抗菌及安全特性，適用于治療細菌性感染［14］。全球范圍內養(yǎng)殖業(yè)中用到的抗生素數量至少占全球使用總數的50%［15-16］。中國的養(yǎng)殖業(yè)中細菌耐藥性和抗性基因的數量不斷增加，準確把握養(yǎng)殖業(yè)中抗生素抗性基因產生的來源是避免產生抗性基因產生以及抗性基因傳播的有效途徑，也是研究抗性基因產生機制的前提基礎。據報道，抗生素抗性主要是獲得性抗性，從而導致細菌的ARGs 在分類學和生態(tài)學上轉移［17-18］。在本試驗中共檢測到的ARGs 共19 種基因型。表明ARGs 在瘤胃中具有普遍性，發(fā)現了不同的ARGs，這可能與飲用水中抗生素的殘留有關。本試驗首次利用宏基因組測序技術，探究不同奶源對犢牛瘤胃細菌的ARGs 的影響，結果表明犢牛瘤胃細菌中抗生素抗性基因有明顯的多樣性，并且飼喂不同奶對抗性基因的影響較大。

將9 組瘤胃液DEGs 進行KEGG 分析顯示，主要分布在人類疾病、新陳代謝、環(huán)境信息處理和遺傳信息處理4 類代謝通路上。在人類疾病代謝通路上，主要富集在傳染病類；與新陳代謝相關的有3 個類別，分別是氨基酸代謝、糖代謝及輔助因子和維生素代謝；在環(huán)境信息處理代謝通路上，主要富集在膜轉運和信號傳導這兩個類別；遺傳信息處理較為富集的類別中，最為富集翻譯類別，推測翻譯在遺傳信息代謝機制中有著重要的作用。分別在NOG、KEGG 和CAZy 數據庫，比較6 組樣品之間豐度的差異情況，60 日齡與180 日齡組在3個數據庫注釋到的瘤胃菌群豐度差異都是最高的，其相對豐度的變化明顯隨著月齡變化，表明犢牛瘤胃中細菌菌群豐度隨著月齡增長差異越來越明顯，這與逄賓賓等［19］的研究結果一致，隨著奶牛的生長發(fā)育，瘤胃菌群豐度提高，其結構越加復雜化。在KEGG 和NOG數據庫中，抗奶與無抗鮮奶組對比和巴氏消毒抗奶與抗奶組對比都有較高的細菌菌群豐度差異，但差異不明顯（P＞0.05）。奶源對犢牛瘤胃基因代謝通路的相對豐度沒有明顯影響，對60 日齡犢牛瘤胃基因參與的代謝通路影響最不明顯，90 日齡抗奶組的犢牛瘤胃基因參與的代謝通路與巴氏消毒抗奶組明顯不同，而180日齡無抗鮮奶組犢牛瘤胃基因參與的代謝通路與其他兩組略有不同，其具體機制還尚需進一步研究。

本試驗中T1-T2、T1-T3、B1-B2 和B1-B3 四組分別含有318、1 398、30 和24 個DEGs。T1-T2 組和T1-T3組的DEGs 在細胞周期（其中包括GSK-3β、CDK2、CDK7）和氨基酸生物合成這兩個常見的代謝通路中明顯富集。有報道稱，GSK-3β 可能介導乳蛋白、乳脂的合成以及奶牛乳腺上皮細胞的增殖［20］。此外，催乳激素受體（Prolactin receptor（PRLR））GSK-3β 的磷酸化作用與泌乳奶牛的產奶量高度相關［21］。這些表明GSK-3β 參與細胞周期和繁殖調節(jié)，但GSK-3β 在瘤胃組織中如何表達尚未見相關報道。周期蛋白依賴性激酶（CDK）驅動細胞周期，而CDK2 是其中一種并在細胞生長及分裂中具有重要作用［22-23］。CDK2 活性的降低會誘導trans-10 共軛亞油酸（CLA）G1 細胞周期停滯，這說明不到1%的乳脂CLA 異構體是由瘤胃細菌產生［24］。CDK7是CDKs家族基因中另一個與相關細胞周期調控有關的基因［25］。在本研究中發(fā)現，T1-T2 組和T1-T3 組的DEGs 在細胞周期（GSK-3β；CDK2和CDK7）和氨基酸的生物合成這兩個代謝通路中明顯富集，上述3 個基因在用不同奶飼喂時瘤胃菌群在3 個階段均差異表達，這可能暗示犢牛前期生長階段（2～6 月齡）的瘤胃細菌通過細胞周期調節(jié)影響脂肪代謝。

4 結論

在eggNOG 數據庫中共比對86 145 條基因獲得了相應的功能注釋。CAZy 數據庫在9 個功能類中共有33 980 條注釋。在KEGG 通路得到1 905 條注釋。在3個數據庫中T1-T3 兩組樣品注釋到的豐度差異均最大。在KEGG 和NOG 數據庫中B2-B3 組和B1-B2 組分別也有較高的細菌菌群豐度差異。

T1-T2、T1-T3、B1-B2 和B1-B3 四 組分 別 含 有318、1 398、30 和24 個差異表達基因。T1-T2、T1-T3 組的DEGs 在細胞周期（GSK-3β；CDK2和CDK7）和氨基酸的生物合成這兩個代謝通路中明顯富集。

本研究共檢測到6 類抗生素抗性基因，包括tet37、tet32、teto、tetw、tetx、aphbid、aPhiiia、aph33ib、antbia、accbie、rmb、ermf、ermg、ermq、mema、bl2b_rob、bl2e_cfxa、baca、sul2，共19 種基因型。外排泵是引起抗生素抗性的主要原因，占56.57%；其次，抗生生素失活占26.26%；細胞保護占12.64%。犢牛瘤胃細菌中抗生素抗性基因具有明顯的多樣性，并且不同奶源對抗性基因的影響較大。