張澤華，霍建忠，郭耀，季興華

(山西醫(yī)科大學附屬大醫(yī)院骨科，太原 030001)

骨質疏松癥是因骨量丟失、骨強度降低及骨微觀結構改變從而增加了脆性骨折風險的一種疾病，它給醫(yī)學帶來了挑戰(zhàn)并對社會經濟造成了威脅。骨質疏松患者的終生骨折風險高達40%，而發(fā)生骨折最常見的部位為脊柱、髖部及手腕，其他部位也可發(fā)生，如肱骨、肋骨等[1]。骨質疏松癥的藥物治療主要分為兩類，一類為促骨形成類藥物，如甲狀旁腺素(parathyroid hormone, PTH)，代表藥物特立帕肽；另一類為抗骨吸收藥物，如雙磷酸鹽類[2]。從細胞水平、動物實驗及患者臨床的應用方面，單純應用PTH治療骨質疏松的有效性已被證實[3-5]，但PTH聯(lián)合用藥存在局限性，如不推薦與抗骨吸收類藥物聯(lián)用[6]，是否能尋找另一種非藥物途徑來聯(lián)合PTH進行骨質疏松治療是一個亟待解決的臨床問題。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)廣泛存在于人體骨髓及松質骨中，可在體內進行自我復制,并成為骨組織修復以及相關疾病的治療選擇[7]。BMSCs具有多向分化能力，目前在體外的提純與擴增技術已成熟?；谏鲜霰尘?，本研究在體外構建組織工程擴增BMSCs，再將其注入骨質疏松大鼠模型的股骨頸內，隨后單獨或聯(lián)合使用PTH，通過Micro-CT測量反映骨密度的相關指標變化，初步研究BMSCs聯(lián)合PTH對骨質疏松性大鼠的局部成骨效果。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

大鼠雌激素ELISA試劑盒(美旋生物科研試劑上海有限公司)；水合氯醛(天津盛鑫源化學試劑有限公司)；胎牛血清(ScienCell生命科技有限公司)；DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)基、無菌PBS溶液、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、含EDTA的0.25%胰蛋白酶(武漢博士德生物工程有限公司)；成骨細胞誘導液 (Cyagen Biosciences，美國)；Rat PTH 1-34(默克生命科學上海有限公司)；全波長酶標儀Eppendorf(中國生命科技有限公司)；Micro-CT(SCANCO Medical AG Inc，瑞士)。

1.2 實驗動物及骨質疏松模型構建

SD IGS雌性大鼠50只，2月齡，SPF級，體質量(210±20)g，飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學實驗中心動物房，正常攝食、進水。將50只雌性大鼠按隨機數(shù)字表法分為A、B、C、D、E 5組，每組10只。濃度8%水合氯醛腹腔麻醉，B、C、D、E組經大鼠腰背部切口進入腹腔切除雙側卵巢， A組僅切除卵巢周圍同等大小的脂肪組織。手術后12周，分別在每組按抽樣檢驗法抽取3只大鼠，心臟穿刺取血液2 ml，1000轉/min離心10 min，收集血清加入大鼠雌激素試劑盒，450 nm酶標儀測定各孔吸光度值，分別計算各組大鼠雌激素平均濃度。隨后將每組抽取的3只大鼠處死，采用Micro-CT檢測股骨頸的骨密度相關指標，即骨小梁數(shù)量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)和骨體積分數(shù)(bone volume to tissue volume,BV/TV)。

1.3 BMSCs培養(yǎng)與鑒定

健康SD IGS雄性大鼠5只，4周齡，SPF級，平均體質量80 g，相關指標符合實驗動物標準。脫頸法處死，碘伏全身浸泡消毒5 min，超凈工作臺上分離雙側股骨，剪掉兩端骨骺，用含10%FBS的DMEM/F12 1∶1完全培養(yǎng)基沖出骨髓至15 ml離心管中，反復吹打，1000轉/min離心3 min，棄上清，加入8 ml完全培養(yǎng)基吹打混勻后接種在4個25 cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶中， 4 ml/瓶，置37℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后半量更換培養(yǎng)基，以后每3 d全量更換新鮮培養(yǎng)基。待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底至細胞融合成單層、密度為80%～90%時，用0.25%胰酶消化，按1∶2的比例進行傳代培養(yǎng)。待傳至P3代時，選擇生長狀態(tài)良好的細胞至離心管，0.25%胰酶消化，4℃離心，1000轉/min，離心3 min，用PBS(含1%胎牛血清)充分洗滌細胞3次，重懸細胞，各管依次加入單克隆抗體CD34、CD45、CD29、CD90，流式細胞儀進行檢測分析。

1.4 術后干預

術后12周，每組剩余7只大鼠。A、B組不做干預處理，其中B組為骨質疏松空白對照組；C組按60 μg/kg劑量背部皮下注射Rat PTH 1-34，隔日1次[8]，連續(xù)注射12周(PTH干預組)；D組顯露雙側股骨頸，采用旋轉進針法注入0.5 ml濃度為5×108/ml的BMSCs(BMSCs干預組)；E組在D組基礎上背部皮下注射Rat PTH 1-34，注射濃度、頻率與C組一致(PTH聯(lián)合BMSCs干預組)。

1.5 干預后大鼠股骨頸骨密度相關指標變化

各組剩余大鼠均在干預12周后處死。大鼠經解剖、分離雙側股骨，小心剔除周圍肌肉后經Micro-CT檢測Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp及BV/TV，并行三維圖像重建。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 骨質疏松大鼠模型鑒定

術后12周，A組大鼠雌激素濃度為(496.2±14.7)ng/L，B、C、D及E組大鼠雌激素濃度分別為(361.7±17.3)、(359.3±15.3)、(362.8±13.9)和(360.9±16.5)ng/L，與A組比較，B、C、D及E組雌激素水平均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但B、C、D及E組間差異不明顯(P>0.05)。Micro-CT檢測5組股骨頸骨密度相關性指標發(fā)現(xiàn)，A組Tb.N、Tb.Th、BV/TV均明顯高于其余4組，Tb.Sp明顯低于其余4組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但B、C、D、E組各組間骨密度相關性指標結果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05；表1)。由此可以證明B、C、D、E組骨質疏松大鼠模型建立成功[9]。

2.2 BMSCs形態(tài)與鑒定

BMSCs接種24 h后觀察可見部分細胞貼壁，48 h后光鏡下可見培養(yǎng)瓶底部有少量梭形細胞，高倍鏡下核仁清晰可見。3 d后再次換液可見密集的細胞團，呈漩渦狀(圖1)。傳代后細胞貼壁較原代快，形態(tài)均勻，生長迅速。流式細胞技術單標法顯示，P3代細胞表達CD29(99.86%)、CD90(99.73%)，幾乎不表達CD34(6.48%)、CD45(0.94%)(圖2)，表明本研究成功獲取并培養(yǎng)了BMSCs。

2.3 干預12周后骨密度相關指標變化

Micro-CT數(shù)據(jù)顯示，單獨使用PTH、注入BMSCs及聯(lián)合使用二者均可改善骨微觀結構，但均未達到與A組相似的正常水平。與B組比較，C、D、E組的Tb.N、Tb.Th及BV/TV顯著增加，Tb.Sp顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與C或D組比較，E組Tb.N、Tb.Th及BV/TV亦顯著增加，Tb.Sp顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05；表2)。各組Micro-CT骨形態(tài)學三維重建見圖3。

3 討 論

隨著“老年世紀”的到來，如何有效治療骨質疏松癥已成為當前臨床的熱點問題，而成功構建骨質疏松的動物模型是實驗進行的關鍵一步。切除卵巢后的大鼠模型與絕經后女性在骨質疏松生理變化過程上相似，已成為建立骨質疏松的經典模型之一[10]。

表1 術后12周各組大鼠股骨頸Micro-CT檢測數(shù)據(jù)

A: sham operation group; B: osteoporosis group; C: PTH intervention group; D: BMSCs intervention group: E: PTH-BMSCs intervention group. Tb.N: trabecular number; Tb.Th: trabecular thickness; Tb.Sp: trabecular separation; BV/TV: bone volume to tissue volume. Compared with group A,*P<0.05.

圖1 原代培養(yǎng)BMSCs的光學顯微鏡觀察

圖2 大鼠BMSCs流式細胞技術鑒定

A: sham operation group; B: osteoporosis group; C: PTH intervention group; D: BMSCs intervention group: E: PTH-BMSCs intervention group. Compared with group A,*P<0.05; compared with group B,#P<0.05; compared with group C,△P<0.05; compared with group D,▲P<0.05.

圖3 各組大鼠股骨頸三維重建圖像

在正常的人體骨髓中，主要有兩類細胞，即起源于造血干細胞的造血細胞和起源于BMSCs的間充質細胞[11]。BMSCs具有自我更新的多向分化潛能，在實驗室中不同的誘導條件下，BMSCs可分化為成骨細胞、成脂細胞、成軟骨細胞等，其數(shù)量與活性在骨組織重建及維持骨量、增強骨密度等方面起著至關重要的作用[12]。有研究表明[13]，老年人群中BMSCs的增殖與分化能力均有不同程度下降，導致骨形成速度減慢，其直接后果是骨量的丟失和骨微結構的破壞，這與骨質疏松的病理觀察相符。經典胚胎學研究和體外成體器官研究表明，微環(huán)境在干細胞的自我更新和分化中起著決定性作用[14]。本實驗結果也表明，與骨質疏松空白對照組比較，BMSCs干預組及BMSCs聯(lián)合PTH干預組中Tb.N、Tb.Th及BV/TV顯著增加，Tb.Sp顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這與文獻報道一致[15]。但如何使注入的BMSCs更多地向成骨方面增殖、分化將是今后在研究詳細機制方面的熱點與難點。

目前，一種人工合成的PTH已被美國食品藥品管理局批準，其促骨形成藥物已在臨床上使用多年。PTH對骨代謝有雙重調節(jié)效應，即小劑量間斷性應用PTH能促進骨髓干細胞向成骨細胞的增殖、分化[16]，而大劑量連續(xù)使用則會上調核子-κB 受體活化因子配體的表達，降低骨保護素的表達，促進破骨細胞的生成并增強其活性，導致骨吸收。本研究選擇去勢大鼠來模擬臨床上的絕經后骨質疏松婦女，隨后施加小劑量間斷性PTH(藥物治療)與局部注射BMSCs(細胞治療)干預，通過Micro-CT骨形態(tài)參數(shù)對比PTH與BMSCs單獨或聯(lián)合使用對骨質疏松的改善作用。實驗結果顯示，單獨使用PTH或BMSCs均可以提高Tb.N、Tb.Th及BV/TV，降低Tb.Sp等相關骨性指標，且二者聯(lián)合使用在抑制骨質疏松大鼠骨量丟失、改善骨微觀結構等方面總體效果更好，但其具體機制目前尚不清楚。查閱文獻[17,18]，我們推測大體機制如下。體外培養(yǎng)的BMSCs經局部注射后，在骨髓微環(huán)境及基質中各種因子的作用下進行自我擴增并向成骨方向分化，這一過程使得注射部位骨量及骨骼強度增加。而PTH則是一種能促進BMSCs向成骨方向分化的重要激素，可通過與成骨細胞表面受體結合，激活cAMP/Ca2+/蛋白激酶C/磷酯酶C等信號通路，增強Ⅰ型膠原等成骨相關基因的表達，刺激成骨細胞的活性，從而促進骨再生，提高骨轉換指標，增加新骨的形成，迅速增加骨量，進而提高骨密度，降低發(fā)生骨折的風險。

綜上，PTH聯(lián)合BMSCs對骨質疏松大鼠模型的干預效果比單獨使用二者效果顯著。本研究創(chuàng)新點在于這種聯(lián)合治療的方法彌補了臨床上對骨質疏松患者無合適聯(lián)合藥物治療的局限，并已顯示出傳統(tǒng)治療方法不可比擬的優(yōu)勢，隨著研究的不斷深入，相信該聯(lián)合治療方法將會為臨床上越來越多的骨質疏松患者提供治療選擇。但也存在不足之處，如股骨頸注入BMSCs時無特定專用器械致細胞損失，缺乏相應的植入細胞標記及細胞植入后的活體示蹤等，需在今后的研究中繼續(xù)探討改進，并嘗試在椎體、脛骨等多部位注射進行驗證。