李自輝，張 寧，趙洪偉，龐 牧，劉樹民

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心 哈爾濱 150040）

脾虛水濕不化為現(xiàn)代中醫(yī)常見病證，患病人數(shù)逐年增加，其與現(xiàn)代人們生活不規(guī)律，不節(jié)飲食，過度勞累等因素密不可分，最終導(dǎo)致重傷脾胃而誘發(fā)各類疾病[1-3]。脾氣不足則氣化無權(quán)，水谷不能布散，水液不能運(yùn)化，故祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)所認(rèn)為脾為氣機(jī)與津液之樞紐[4,5]。近年來研究表明，中藥玄參多用于涼血滋陰，瀉火解毒作用的相關(guān)疾病治療，但醫(yī)學(xué)古籍明確記載玄參具有利水之功效，且又歸胃經(jīng)，而現(xiàn)代中醫(yī)對于此作用的臨床應(yīng)用鮮有報導(dǎo)[6,7]。本課題組前期依托國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃），已驗證玄參對脾虛水濕不化具有一定的治療作用，故本實(shí)驗運(yùn)用血清代謝組學(xué)技術(shù)，對其利水功效的機(jī)制進(jìn)行深度探究，同時找尋潛在生物標(biāo)志物，通過關(guān)鍵性靶點(diǎn)尋找相關(guān)聯(lián)代謝通路，為玄參治療或緩解這類疾病做出理論支撐，也為今后新藥研發(fā)與臨床的安全應(yīng)用提供有力的科研依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

AcquityTHUPLC超高液相色譜與Q-TOF-MS質(zhì)譜儀（Waters公司）；KQ-SOB超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；MassLynx V3.1（Waters公司）；QI 3.0軟件（Waters公司）；KDC-160HR高速冷凍型離心機(jī)（科大創(chuàng)新有限公司）；AL204電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；MS-3 digital蝸旋儀（德國IKA公司）

1.2 藥品與試劑

高脂低蛋白飼料（自制，成分為蔗糖47.5%，氯化膽堿0.2%，纖維素5%，蛋氨酸0.3%，酪蛋白7%，淀粉15%，玉米油5%，多礦3.5%，豬油15%，多維1%，膽固醇0.5%）、AIN-76A正常純化飼料（北京澳協(xié)力飼料廠）、乙睛（美國Fisher公司）、甲酸（美國Dikma科技公司）均為色譜級、蒸餾水（屈臣氏公司）；胃泌素酶聯(lián)免疫試劑盒（北京方程生物公司，批號：20150701）；白蛋白（ALB）、總蛋白（TB）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、總膽固醇（CHOL）、D-木糖酶聯(lián)免疫試劑盒（南京建成生物研究所，批號：20150706）、藍(lán)色葡聚糖（DB-2000，法瑪西亞公司）。

1.3 實(shí)驗動物

SD大鼠，SPF級，雄性，體重220± 20 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK（遼）2015-0001。飼養(yǎng)地點(diǎn)：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥實(shí)驗動物中心屏障系統(tǒng)內(nèi)。室內(nèi)溫度(22±1)℃，濕度為45%。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗，所有實(shí)驗大鼠的使用和喂養(yǎng)嚴(yán)格遵照動物保護(hù)協(xié)會所規(guī)定的有關(guān)條款。

1.4 藥物制備

玄參飲片購自黑龍江省藥材公司（批號：20120623012），經(jīng)本校中藥資源與開發(fā)教研室王振月教授鑒定為玄參科植物玄參（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）的干燥塊根。玄參生藥經(jīng)適量粉碎后，分別用10倍和8倍量的蒸餾水恒溫加熱進(jìn)行提?。ㄋ逯蠓ǎ?，兩煎液均冷凝回流1.5 h，合并藥液，過濾，減壓濃縮加工，得到呈棕褐色，甜膩芳香氣味，略帶苦味的水煎液，再經(jīng)低溫干燥機(jī)中凍干，得到凍干粉末，提取后計算其出膏率為30.7%[8]。

2 方法

2.1 實(shí)驗動物造模與給藥

SD雄性大鼠30只，隨機(jī)分為空白組、模型組、玄參組，每組10只?？瞻捉M大鼠飼以正常飼料喂養(yǎng)；模型組與玄參組飼以高脂飼料喂養(yǎng)，且每日進(jìn)行尾部負(fù)10%體重游泳（水溫15-20℃，水深40-45 cm），大鼠力竭為止（大鼠鼻尖沒入水中10 s以上，即判斷為大鼠力竭）。連續(xù)6周后，玄參組按人體臨床上限的2倍劑量折算后給予大鼠（即2.9 g生藥材·kg-1），空白組和模型組i.g.給予10 mL·kg-1·d-1生理鹽水，連續(xù)2周[9]。

2.2 尿液D-木糖含量的測定

實(shí)驗結(jié)束前兩天，禁食12 h，灌胃4 mL的3%D-木糖溶液，試驗期間禁食且自由飲水，收集給予D-木糖后5 h的尿液，按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明進(jìn)行含量測定。

2.3 水負(fù)荷指數(shù)的測定

實(shí)驗結(jié)束前一天，禁食12 h，稱量體重，作為基本值，即水負(fù)荷前體重，控制實(shí)驗溫度25℃，每只大鼠用10%生理鹽水腹腔注射，水負(fù)荷后分別稱量0、1、2、4、6 h的體重。實(shí)驗期間禁水禁食，按體重下降比=（水負(fù)荷時體重－水負(fù)荷前體重）/水負(fù)荷前體重×100%，分別以水負(fù)荷差值描記曲線，曲線下面積積分即為水負(fù)荷指數(shù)。故水負(fù)荷指數(shù)越大表明水液在體內(nèi)留存時間越長，水潴留情況越嚴(yán)重。

2.4 血清蛋白、胃泌素及胃排空率的測定

實(shí)驗結(jié)束當(dāng)天，末次給藥后，禁食12 h，每只大鼠灌胃0.4 mL的2%DB-2000溶液，30 min后將大鼠麻醉處死，腹主動脈取血，將取出的血液常溫下靜置40 min，4℃下，3500 r·min-1離心10 min，取上清液，-80℃冰箱存儲備用。嚴(yán)格遵照試劑盒說明的指示操作，對血清中ALB、TB、HDL-C、LDL-C、CHOL及胃泌素進(jìn)行含量測定。取出大鼠的胃，沿胃大彎處剪開，殘留物溶于4.0 mL水中，12000r·min-1離心5 min，取上清液于620 nm處測定吸光度A，A1為大鼠胃內(nèi)DB-2000的吸光度，A2為基準(zhǔn)DB-2000的吸光度，按照1－A1/A2計算胃排空率。

2.5 代謝組學(xué)血清樣品的處理

將部分-80℃冰箱存儲血清樣本取出解凍，加入9倍體積冰冷的甲醇，混勻后4℃13000 r·min-1離心15 min，取上清液存于離心管，重復(fù)上述條件離心一次，最后取上清液儲存于-80℃冰箱備用，進(jìn)行代謝組學(xué)分析。

2.6 UPLC與MS的實(shí)驗條件

WATERS ACQUITYTHUPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）流動相0.05%甲酸乙睛溶液（A）-0.05%，甲酸水溶液（B），洗脫梯度：0-4 min 5-30%A，4-7 min 30%-50%A，7-11 min 50%-70%A，11-14 min 70-100%A，14-15 min 100%A，15-16 min 100%-5%A，16-18 min 5%A。進(jìn)樣量2 μ L，流速0.4 mL·min-1，柱溫40℃[10]。MS條件采用電噴霧離子源（ESI），正離子與負(fù)離子模式下檢測，Lock Mass采用全掃描方式，質(zhì)量掃描范圍為質(zhì)荷比m/z 100～1500，噴霧頻率為10 s，根據(jù)Waters公司在線系統(tǒng)，進(jìn)行亮氨酸腦啡肽質(zhì)量校正，正離子m/z 556.2771[M＋H]＋，負(fù)離子m/z 556.2615[M－H]－，其余質(zhì)譜條件見表1。

2.7 大鼠血清樣本潛在標(biāo)志物的代謝組學(xué)分析

應(yīng)用UPLC-TOF-MS手段針對所得離子產(chǎn)生的質(zhì)譜峰進(jìn)行分析，制得總離子流色譜圖并同時開展對離子峰的提取、對齊和匹配，通過QI與MarkerLynx XS軟件的幫助可明確數(shù)據(jù)中代謝物的分子質(zhì)量，并將所獲數(shù)據(jù)在篩除外源性的干擾成分后進(jìn)入EZinfo 2.0軟件處理分析，對大鼠血清血清樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA處理（principal components analysis，主成分分析），采用Scores plot圖說明組間的離散程度，以此判斷大鼠血清樣本各組軌跡的相似度情況及是否呈現(xiàn)出聚類效應(yīng)。結(jié)合S-plot圖所選出潛在生物標(biāo)志物的組間變化趨勢，采用離子變量（VIP）＞1作為投射篩選條件，找出重要性生物標(biāo)志物，同時聯(lián)合人類代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫（HMDB）和京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（KEGG）及相關(guān)文獻(xiàn)的收集整理，最終得出對鑒定出的代謝產(chǎn)物及其相關(guān)代謝通路的分析結(jié)果[11]。

2.8 數(shù)據(jù)處理

各組實(shí)驗數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件做統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果以xˉ±s表示，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，組間比較用最小顯著差異（LSD）進(jìn)行檢驗，P＜0.05為有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 玄參對脾虛水濕不化大鼠藥效學(xué)指標(biāo)的影響

與空白組相比，模型組ALB、TB、HDL-C、LDL-C、CHOL、胃泌素、胃排空率、D-木糖排泄率及水負(fù)荷指數(shù)均有極顯著性差異的改變（P＜0.01）；與模型組相比，給予玄參干預(yù)后，大鼠ALB、TB、HDL-C的含量及D-木糖排泄率與水負(fù)荷指數(shù)極顯著性回調(diào)（P＜0.01），LDL-C、CHOL、胃泌素及胃排空率具有顯著性的改善（P ＜ 0.05）（圖1，表2）。

3.2 大鼠血清代謝總離子色譜圖

應(yīng)用MarkerLynx XS對大鼠血清樣品的離子峰進(jìn)行識別與匹配，得到空白組、模型組和玄參組的總離子流色譜圖（TIC）（圖2）。通過觀察可說明三組數(shù)據(jù)代謝產(chǎn)物分離，輪廓清晰。

3.3 大鼠血清數(shù)據(jù)的分析

通過對UPLC-TOF-MS產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，應(yīng)用非監(jiān)督性3D-PCA和多維與降維的處理，以此表現(xiàn)大鼠血清樣本代謝輪廓的狀態(tài)。結(jié)果表明空白組與模型組明顯分開，提示兩組之間存在顯著性差異且造模成功（圖3）；模型組相對遠(yuǎn)離玄參組，顯示出給藥后大鼠血清發(fā)生了明顯的變化（圖4）；空白組、模型組與玄參組同時比較可發(fā)現(xiàn)，3組均呈現(xiàn)出各自聚類且玄參組存在向正常給藥組回調(diào)的趨勢，說明玄參可改善模型組大鼠代謝的偏離（圖5）。觀察S-plot圖可知，大多數(shù)代謝產(chǎn)物離子在原點(diǎn)周圍聚集，偏離原點(diǎn)的離子占少數(shù)，說明兩組之間存在差異（圖6）；執(zhí)行VIP＞1的篩選條件，可得到VIP-plot圖并預(yù)選出潛在生物標(biāo)志物（圖7）。

表1 樣本分析方法的MS條件

表2 玄參對脾虛水濕不化大鼠藥效學(xué)指標(biāo)的影響（± s,n=10）

表2 玄參對脾虛水濕不化大鼠藥效學(xué)指標(biāo)的影響（± s,n=10）

注：*表示與空白組比較*P＜0.05，**P＜0.01；#表示與模型組比較#P＜0.05，##P ＜ 0.01

玄參組31.35±3.14##51.36±3.68##31.76±4.26##12.48±3.29#2.08±0.49#67.44±13.06#50.52±10.59#30.49±6.68##92.97±9.62##ALB/mg·L-1 TB/g·L-1 HDL-C/ng·L-1 LDL-C/mmol·L-1 CHOL/mmol·L-1胃排空率/%胃泌素/ng·L-1 D-木糖排泄率/%水負(fù)荷指數(shù)/%空白組34.08±3.50 58.06±4.58 34.84±3.73 11.17±2.86 1.61±0.35 70.79±11.41 53.82±7.74 31.21±6.92 75.74±11.29模型組27.12±2.71**46.03±4.28**24.65±4.88**16.02±4.01**2.74±0.75**53.16±11.28**40.76±8.40**22.84±4.97**107.90±12.34**

3.4 大鼠血清數(shù)據(jù)的潛在生物標(biāo)志物

通過對大鼠血清代謝產(chǎn)物變化的預(yù)測，尋找符合VIP＞1，fold change＞1.2或＜0.8及q-value＞0.5的代謝產(chǎn)物，對空白組與模型組進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)46個差異代謝產(chǎn)物（圖8），模型組與玄參組比較發(fā)現(xiàn)31個差異代謝產(chǎn)物（圖9），兩者取交集共得到29個差異代謝物，即為共同潛在生物標(biāo)志物（表3）；經(jīng)過離子強(qiáng)度的比較發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組17個生物標(biāo)志物極顯著性上調(diào)（P＜0.01），6個生物標(biāo)志物顯著性上調(diào)（P＜0.05），3個生物標(biāo)志物極顯著性下調(diào)（P ＜ 0.01），3個生物標(biāo)志物顯著性下調(diào)（P＜0.05）；給藥干預(yù)后，指標(biāo)全部發(fā)生回調(diào)，玄參組13個生物標(biāo)志物極顯著性下調(diào)（P ＜0.01），10個生物標(biāo)志物顯著性下調(diào)（P ＜0.05），3個生物標(biāo)志物極顯著性上調(diào)（P＜0.01），3個生物標(biāo)志物顯著性上調(diào)（P ＜0.05）（圖10）。

圖1 玄參對脾虛水濕不化大鼠藥效學(xué)指標(biāo)的影響

圖2 不同組別大鼠血清代謝的正離子（A）和負(fù)離子（B）TIC圖

圖3 來源于正離子（A）和負(fù)離子（B）模式下的模型組與空白組3D-PCA圖

圖4 來源于正離子（A）和負(fù)離子（B）模式下的模型組與玄參組3D-PCA圖

圖5 來源于正離子（A）和負(fù)離子（B）模式下UPLC分析三組3D-PCA圖

圖6 來源于正和負(fù)離子模式下模型組對正常（A,B）與玄參給藥大鼠（C,D）的S-plot圖

圖7 來源于正和負(fù)離子模式下模型組對正常（A,B）與玄參給藥大鼠（C,D）的VIP-plot圖

圖8 大鼠血清代謝產(chǎn)物模型組與空白組互作相關(guān)及聚類分析熱圖

圖9 大鼠血清代謝產(chǎn)物模型組與玄參組互作相關(guān)及聚類分析熱圖

3.5 血清中潛在生物標(biāo)志物的分類

針對被篩選出的潛在生物標(biāo)志物，應(yīng)用HMDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類，可知在細(xì)胞位置中，大約32%屬于細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasm），36%屬于細(xì)胞外基質(zhì)（Cytoplasm extracellular），9%屬于線粒體（Mitochondria），16%屬于細(xì)胞外模（Membrane），7%屬于細(xì)胞核（Nucleus）；在生物功能上，大約10%屬于能量源（Energy source），17%屬于燃料和能量存儲（Fuel and energy storage），6%屬于細(xì)胞信號（Cell signaling），20%屬于燃料或能量源（Fuel or energy source），25%屬于膜組成（Membrane component），22%屬于膜完整性（Membrane integrity）；在化學(xué)成分上，大約28%屬于脂類（Lipids），45%屬于氨基酸和肽類（Peptides and Amino acid），7%屬于核苷酸類似物（Nucleosides acid analogues），13%屬于有機(jī)酸及其衍生物（Organic acids and derivatives），7%屬于芳香化合物（Aromatic compounds）（圖11）。

表3 在正負(fù)離子模式下玄參對脾虛水濕不化大鼠血清中共同潛在生物標(biāo)志物的信息

3.6 血清中潛在生物標(biāo)志物的通路分析

將被篩選出來的生物標(biāo)志物進(jìn)行富集，以此作為玄參對脾虛水濕不化大鼠血清代謝組學(xué)中的標(biāo)志性生物標(biāo)志物，通過通路分析來尋找相關(guān)的代謝途徑。潛在代謝通路的臨界值應(yīng)大于0.10，結(jié)果顯示出共作用于13個代謝通路。關(guān)鍵代謝途徑主要富集于原發(fā)性膽汁酸生物合成（Primary bile acid biosythesis）、葉酸合成（Folate biosythesis）、鞘 脂 類 代 謝（Sphingolipid metabolism）和甘油磷脂代謝（GlycerophoSphingolipid metabolism）。在玄參給藥干預(yù)后，代謝通路紊亂的現(xiàn)象明顯改善，代謝產(chǎn)物的含量出現(xiàn)回調(diào)趨勢，在代謝通路的水平上，顯示出玄參對脾虛水濕不化大鼠的血清代謝有明顯的治療與緩解的作用（圖12，13），（表4）。

4 討論

4.1 原發(fā)性膽汁酸合成

圖12 玄參調(diào)節(jié)代謝通路的分析圖

原發(fā)性膽汁酸合成，又可稱為初級膽汁酸代謝，其主要通過膽固醇的形式在肝臟細(xì)胞與微粒體中進(jìn)行合成，并由膽酰輔酶A與甘氨酸調(diào)控肝臟中膽汁酸的代謝[12]。研究發(fā)現(xiàn)，膽汁酸具有消化及乳化膠束的膳食脂肪和油脂的功能，降低食糜對食物膠體過度的存儲，體現(xiàn)出膽汁酸能充分發(fā)揮出表面活性劑的能力；同時，初級膽汁酸分泌量提高可促進(jìn)膽汁流量的增加，改善并提升機(jī)體的消化系統(tǒng)對食物及脂肪的代謝功能，促進(jìn)消化或代謝后能量平衡分配[13，14]。本實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)，玄參可促進(jìn)膽固醇通路的7-羥基-4-膽甾烯-3-酮的含量增加，直接調(diào)節(jié)膽固醇合成的速度加快；此外，去氧膽酸及?；蛆Z去氧膽酸的含量在藥玄參干預(yù)后，出現(xiàn)下調(diào)的現(xiàn)象，從而抑制甘氨酸的合成增加，導(dǎo)致肝臟對膽汁酸的合成加快并促進(jìn)膽汁的分泌，充分緩解脾虛不化大鼠膽汁酸代謝功能異常的現(xiàn)象。本研究也發(fā)現(xiàn)，玄參對膽酰輔酶A代謝的多個產(chǎn)物均具有下調(diào)作用，提示玄參藥性微寒，對于物質(zhì)及能量代謝常處于抑制的作用，故對生物標(biāo)志物多為下調(diào)，但其具體原

因，需要進(jìn)一步的探討。

表4 利用MetPA分析玄參調(diào)節(jié)的代謝通路

圖13 玄參對共同潛在生物標(biāo)志物及主要代謝通路的影響

4.2 葉酸合成

葉酸合成，亦可稱葉酸代謝，主要作為機(jī)體的甲基提供者，參與細(xì)胞中脫氧核糖核酸的合成及一系列的甲基化反應(yīng)[15]。葉酸主要由谷氨酸、喋啶核和對氨苯甲酸這3種化學(xué)成分組成，其生物功能一般為一碳單位合成的供體、胸腺及嘌呤嘧啶的參與者、氨基酸代謝及血紅蛋白的載體等[16]。近來研究表明，葉酸代謝存在的個體差異性較大，其對機(jī)體內(nèi)部的改變及外部環(huán)境的影響具有靈敏的反應(yīng)，因此，葉酸含量是衡量機(jī)體是否處于健康的一個關(guān)鍵因素，故普遍認(rèn)為機(jī)體葉酸缺乏是疾病發(fā)生的重要誘因[17，18]，但機(jī)體內(nèi)葉酸過量常會導(dǎo)致食欲不振、消化不良等癥狀，其與脾虛水濕不化反應(yīng)相似。本研究結(jié)果顯示，給與玄參干預(yù)脾虛水濕不化模型大鼠后，導(dǎo)致四氫生物喋呤及四氫生喋呤醇氨的分泌量減少，減慢體內(nèi)細(xì)胞對葉酸合成的速率，改善機(jī)體葉酸的水平；提示研究還發(fā)現(xiàn)對于四氫喋呤的同分異構(gòu)體，例如：乳酰四氫喋呤、6-丙酮酰四氫喋呤及7,8-二氫喋呤等，均具有一定的下調(diào)作用，說明玄參對葉酸合成代謝的影響可能體現(xiàn)出中藥多靶點(diǎn)的特性。

4.3 鞘脂類代謝

鞘脂類代謝是一種存在于機(jī)體神經(jīng)細(xì)胞膜或腦組織中，主要通過已鞘氨醇為基礎(chǔ)化合物的復(fù)雜反應(yīng)[19]。鞘脂類代謝主要代謝產(chǎn)物有脂肪酸、鞘氨醇及磷酸膽堿等，其中神經(jīng)酰胺是代謝過程中最為重要的中間產(chǎn)物，也是近年來對鞘脂類代謝對于疾病預(yù)防與治療方面研究關(guān)注的重點(diǎn)[20]。本實(shí)驗給藥后發(fā)現(xiàn)，鞘磷脂與葡萄糖神經(jīng)酰胺均出現(xiàn)下調(diào)的趨勢，兩種物質(zhì)均與神經(jīng)酰胺具有緊密的聯(lián)系，表明玄參通過神經(jīng)酰胺來影響鞘磷脂代謝通路，改善脾虛不化模型大鼠脂類代謝異常的現(xiàn)狀，從而提升機(jī)體對病機(jī)的免疫調(diào)控能力。

4.4 甘油磷脂代謝

甘油磷脂代謝是廣泛存在于機(jī)體內(nèi)一種特殊性的水解反應(yīng)，其主要通過各種磷脂酶的水解作用，維持與平衡新陳代謝的運(yùn)作，從而保證機(jī)體內(nèi)能量與各種代謝的正常進(jìn)行，故磷脂酶的含量減少，將會產(chǎn)生大量磷脂膽堿類化合物并導(dǎo)致嚴(yán)重的肝脾功能紊亂，發(fā)生各種精神障礙及代謝異常的疾病[21]。實(shí)驗結(jié)果顯示，玄參干預(yù)后溶血磷脂膽堿與甘油磷酰膽堿的含量降低，導(dǎo)致磷脂膽堿的分泌量減少，可促進(jìn)磷脂酶含量的增多并提升機(jī)體的免疫能力，確保各項代謝能平穩(wěn)進(jìn)行。

本研究通過血清代謝組學(xué)方法，尋找出29個具有生物學(xué)意義的差異潛在生物標(biāo)志物，初步探究玄參治療脾虛水濕不化的代謝通路，主要的四條分別是：原發(fā)性膽汁酸生物合成、葉酸合成、鞘脂類代謝和甘油磷脂代謝。故表明玄參對脾虛水濕不化病證具有一定的治療作用，從而為玄參古存今失的利水功效提供理論依據(jù)的支撐，為進(jìn)一步臨床的合理安全應(yīng)用提供科學(xué)的論證。