劉 舒，宋鳳瑞，皮子鳳，劉志強

（中國科學院長春應用化學研究所，吉林省中藥化學與質(zhì)譜重點實驗室及化學生物學實驗室 長春 130022）

1 引言

中醫(yī)藥治療疾病具有整體協(xié)同作用的優(yōu)勢和特色，在慢性疾病、代謝綜合性疾病等病理機制復雜的疾病治療中顯示出了獨特的優(yōu)勢。然而，由于“中藥藥效物質(zhì)基礎不清楚、作用機制不明晰”等問題的存在，致使中藥長期以來受到眾多質(zhì)疑。其中，中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎不清楚是制約人們科學認識中藥的核心問題。

然而，中藥成分十分復雜，即使是單味藥，仍可能含有成千上萬種化學成分，并且，傳統(tǒng)中藥以口服用藥為主，首過效應的存在致使其進入體內(nèi)的原型成分和代謝產(chǎn)物濃度均較低，加之內(nèi)源性基質(zhì)干擾嚴重，致使中藥體內(nèi)微量和痕量未知新成分的快速精準辨識十分困難，而這些成分往往是發(fā)揮藥效的關鍵成分；此外，進入體內(nèi)的中藥原型成分和代謝成分，并不一定都是效應成分，需要對其進行進一步的活性篩選和評價才能最終闡明中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)，目前常用的活性篩選方法是基于分離得到單體成分的前提下進行的，不僅微量痕量成分的分離制備十分困難，而且分離得到的單體成分很多為非效應成分，耗時費力，致使中藥體內(nèi)藥效成分的快速篩選成為中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)研究的另一巨大挑戰(zhàn)。鑒于此，急需突破中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)的高效發(fā)現(xiàn)技術(shù)，構(gòu)建中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)的快速發(fā)現(xiàn)和精準辨識方法，解決制約中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎研究的關鍵科學難題。

2 基于“體外-體內(nèi)”多維化學物質(zhì)組逐層遞進關聯(lián)分析策略的中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎研究思路

圖1 “體外-體內(nèi)”多維化學物質(zhì)組逐層遞進關聯(lián)分析的“四步法”研究思路

眾所周知，傳統(tǒng)中藥以口服用藥為主，其化學成分必然會受胃腸道酸堿性、腸道微生物及代謝酶等影響發(fā)生轉(zhuǎn)化，且吸收進入體內(nèi)后，會在肝臟作用下發(fā)生進一步的代謝反應，使體內(nèi)藥源性成分除原型成分外，還可能存在大量代謝產(chǎn)物。針對口服中藥這一特點，作者團隊提出了基于“體外-體內(nèi)”多維化學物質(zhì)組逐層遞進關聯(lián)分析策略的中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎研究思路，增強了分析靶向性，實現(xiàn)中藥體內(nèi)藥效成分的快速發(fā)現(xiàn)和精準辨識。

具體闡述如下：①建立基于質(zhì)譜特征診斷離子的中藥復雜體系化學成分結(jié)構(gòu)精準表征方法，闡明中藥體外原型化學物質(zhì)組；并以此為基礎，建立包含質(zhì)譜特征診斷離子、分子量和色譜保留時間等信息的本地化學成分數(shù)據(jù)庫；②建立藥物體外腸內(nèi)菌代謝和肝微粒體代謝研究模型，研究中藥的體外腸內(nèi)菌代謝物質(zhì)組和肝微粒代謝物質(zhì)組，闡明各類成分（如皂苷、三萜、寡糖酯等）的代謝規(guī)律，并將體外代謝物質(zhì)組及其特征代謝規(guī)律加入到本地化學成分數(shù)據(jù)庫，使數(shù)據(jù)庫信息進一步擴充；③基于已構(gòu)建的本地化學成分數(shù)據(jù)庫，靶向分析在體糞便和肝臟中的藥源性成分，并將相關代謝產(chǎn)物信息加入到本地化學成分數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫信息得到最終完善；以此為指導，靶向篩選血液和靶器官中的藥源性成分，闡明體內(nèi)化學物質(zhì)組；④以體內(nèi)化學物質(zhì)組研究結(jié)果為指導，進行網(wǎng)絡藥理學分析（即靶向網(wǎng)絡藥理學分析），闡明作用于疾病靶點和通路的化學成分，并對預測的關鍵靶蛋白進行生物學驗證，最終明確中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎及其作用機制。并且，對于中藥復方體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎研究，可以基于上述研究策略，進行“特征單體成分—單味藥材成分—中藥復方成分”的逐層遞進分析，從而實現(xiàn)中藥復方體內(nèi)藥效成分的精準辨識。

該研究策略充分考慮了中藥成分復雜、理化性質(zhì)及含量差異懸殊、同分異構(gòu)體多、代謝產(chǎn)物動態(tài)變化且未知成分多、標準品缺乏等特點，通過逐層遞進分析分解解析難度，由易到難，循序漸進，有目的性和導向性的解析體內(nèi)化學物質(zhì)組和體內(nèi)藥效物質(zhì)組，可以極大地提高復雜基質(zhì)樣品中體內(nèi)化學物質(zhì)組和體內(nèi)藥效物質(zhì)組的發(fā)現(xiàn)準確度和效率，解決微量、未知、結(jié)構(gòu)類似、動態(tài)變化的體內(nèi)藥效成分快速發(fā)現(xiàn)和精準辨識難題（圖1）。

3 中藥復雜體系成分鑒定方法的建立及應用

中藥具有成分復雜、同分異構(gòu)體多、未知成分繁多、標準品缺乏等特點，致使中藥成分的分析鑒定十分困難。為此，在體外原型化學物質(zhì)組研究方面，作者研究團隊將色譜分離、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)分析和質(zhì)譜技術(shù)創(chuàng)新性融合，構(gòu)建了中藥復雜體系化學成分分析方法。例如，針對中藥梔子體外化學物質(zhì)組鑒定難題，作者研究團隊建立了多級分離結(jié)合特征診斷離子匹配的微量成分和同分異構(gòu)體成分精準辨識方法，成功鑒定出了包括環(huán)烯醚萜類、黃酮類、三萜類、單萜類、二萜類及多酚類等在內(nèi)的71種化學成分，并且利用離子淌度三級分離技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)了梔子中4種新的西紅花苷-3和西紅花苷-4同分異構(gòu)體[1]（圖2）。建立基于質(zhì)譜診斷離子的“特征單體成分—單味藥材成分—中藥復方成分”逐層遞進分析方法，對烏頭湯、復方夏連膠囊等進行了研究，獲得了其體外化學物質(zhì)組[2,3]。在體外代謝物質(zhì)組研究方面，利用體外腸內(nèi)菌代謝和體外肝微粒體代謝模型，實現(xiàn)了藥物體外代謝物質(zhì)組的分析和表征。例如，馮等研究表明，人參皂苷類成分在腸道菌群作用下主要產(chǎn)生去糖基化產(chǎn)物，生成更易吸收的弱極性成分。腸內(nèi)菌代謝的主要產(chǎn)物在肝微粒體作用下，主要產(chǎn)生羥基化等氧化還原反應產(chǎn)物，初步闡明了人參皂苷I相代謝的循序漸進及系統(tǒng)性，可為后續(xù)的人參皂苷類成分的體內(nèi)代謝研究提供重要參考[4]。在體內(nèi)藥效成分研究方面，作者團隊建立了以入血成分為導向的靶向網(wǎng)絡藥理學分析方法，明確了烏頭湯治療佐劑型關節(jié)炎的主要活性成分為烏頭類生物堿、麻黃堿，以及甘草苷、芒柄花素、芍藥苷等成分[5]。復方夏連膠囊治療慢性萎縮性胃炎的主要活性成分為小檗堿、甘草酸、漢黃芩素及人參皂苷等9種成分[6]。

圖2 多級分離結(jié)合特征診斷離子匹配的梔子中微量成分和同分異構(gòu)體成分分析

4 基于“體外-體內(nèi)”多維化學物質(zhì)組逐層遞進關聯(lián)分析策略的茯苓治療阿爾茲海默癥的體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎研究

茯苓三萜酸類成分是茯苓中的主要活性成分之一，但其含量低、結(jié)構(gòu)相似、同分異構(gòu)體多、電離效率低，尤其是缺乏足夠的對照品，嚴重阻礙了茯苓三萜酸類成分的定性分析?；诖?，首先，我們提出了一種超高效液相色譜-多維質(zhì)譜法結(jié)合UNIFI軟件數(shù)據(jù)后處理技術(shù)的靶向數(shù)據(jù)分析策略，用于茯苓三萜酸類成分的快速定性分析，從茯苓中共鑒定出121種茯苓三萜酸類成分，以此作為茯苓三萜酸類成分的本地化學成分數(shù)據(jù)庫[7]。其次，選取特征性茯苓三萜酸類成分單體作為研究對象，利用體外大鼠腸內(nèi)菌代謝和大鼠肝微粒體代謝模型，研究了茯苓三萜類成分的腸內(nèi)菌及肝微粒代謝規(guī)律，發(fā)現(xiàn)茯苓三萜類成分在腸內(nèi)菌作用下基本不發(fā)生代謝反應，而是直接通過小腸上皮細胞吸收進入體內(nèi)；而茯苓三萜酸類成分在肝微粒體作用下主要發(fā)生氧化反應，包括單加氧和雙加氧的代謝反應，以此規(guī)律為指導，推測其它茯苓三萜酸類成分在體內(nèi)可能產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，將其信息加入到本地化學成分數(shù)據(jù)庫。以此數(shù)據(jù)庫為依托，對吸收進入體內(nèi)的茯苓三萜酸類成分進行篩選和鑒定，共鑒定出62種原型成分和59種代謝物。最后，以入血成分為指導，通過靶向網(wǎng)絡藥理學分析方法，篩選出治療阿爾茨海默病的有效吸收成分，初步闡明了茯苓治療阿爾茲海默癥的體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎[8]。

5 總結(jié)與展望

中醫(yī)藥作為具有豐富科學內(nèi)涵的復雜體系，在多成分多靶點協(xié)同整合治療疾病方面體現(xiàn)出了其獨特的優(yōu)勢，然而，也由于其體系的復雜性，給其藥效物質(zhì)基礎研究帶來的極大的挑戰(zhàn)，致使多數(shù)中藥治療疾病的藥效物質(zhì)基礎尚不十分清楚，大大限制了人們對中藥治療疾病的科學認識。因此，中醫(yī)藥的傳承和發(fā)展，必須借助不斷發(fā)展的現(xiàn)代科學技術(shù)建立適合中醫(yī)藥復雜體系的創(chuàng)新方法，來深入研究中藥的物質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)，并在此基礎上明確其有效成分、闡明其物質(zhì)基礎和作用機制，才能使其在世界范圍被認可、接受，才能從根本上保證中藥質(zhì)量的穩(wěn)定可控，促進中藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。近年來，中藥學者對于中藥藥效物質(zhì)基礎研究日益重視，新的研究思路、研究方法和先進技術(shù)手段被應用于中藥藥效物質(zhì)基礎研究中，取得了重大突破。未來，隨著分析檢測技術(shù)、生物信息學技術(shù)等的發(fā)展，將會產(chǎn)生更多的新思路、新方法，用于解決中藥藥效物質(zhì)基礎研究中存在的技術(shù)瓶頸問題，從而促進中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展。