田林娜，李亦凡，林丹丹，范昌健，吳 鵬，盧 娟，陳際名，馬 嘯,

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)體育學(xué)院 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院普洱茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室昆明 650201；3.云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院 昆明 650201）

鐵皮石斛是多年生蘭科草本植物，是一種較為常見的中草藥，近年來受到諸多媒體的關(guān)注后，具有較高的認(rèn)知度和知名度。鐵皮石斛的入藥部位多為莖部，高度大約在15-30 cm之間，直徑3-7 mm，比較常見的形態(tài)為干燥后經(jīng)加工成為團(tuán)狀，俗稱“鐵皮楓斗”[1,2]。鐵皮石斛中的多糖類組分、石斛堿、芪類及其衍生物、生物堿、氨基酸、微量元素及揮發(fā)性成分（烴類、醛類、酮類、烯烴類、醇類、酯類等）等有較強(qiáng)的天然活性，具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤等功效，近年來關(guān)于鐵皮石斛的新功效開發(fā)工作也在蓬勃開展。

近年來，隨著我國(guó)大眾體育與全民健身浪潮的興起、社會(huì)體育的推廣力度和收接受程度日益加深，人民群眾參與社會(huì)體育活動(dòng)的熱情高漲，豐富的體育項(xiàng)目與運(yùn)動(dòng)方式為其提供多種選擇。然而，不同類型的體育項(xiàng)目，其運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的不同，勢(shì)必會(huì)對(duì)運(yùn)動(dòng)者機(jī)體帶來不可避免的疲勞和損傷現(xiàn)象。EGFR（epidermal growth factor receptor）是一種糖蛋白，是表皮生長(zhǎng)因子受體（HER）的一種，上皮生長(zhǎng)因子（EGF）細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的酪氨酸激酶型受體。廣泛分布于哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面，EGFR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的作用。EGFR作為細(xì)胞生長(zhǎng)因子的一種參與了骨骼肌再生過程，并且發(fā)揮了重要的再生修復(fù)作用。根據(jù)2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》記載，鐵皮石斛主治筋骨痿軟，骨骼肌是重要的運(yùn)動(dòng)器官，隨著近年來大眾運(yùn)動(dòng)健身習(xí)慣的養(yǎng)成，肌肉損傷預(yù)防和損傷恢復(fù)成了非常受關(guān)注的領(lǐng)域[3-5]。EGFR作為細(xì)胞生長(zhǎng)因子的一種參與了骨骼肌再生過程，并且發(fā)揮再生修復(fù)的作用[3-5]。因此，本研究將明確鐵皮石斛水提物對(duì)C2C12細(xì)胞和骨骼肌組織中EGFR的調(diào)控作用為目標(biāo)，探明其對(duì)肌肉損傷修復(fù)作用的機(jī)理具有較強(qiáng)的科學(xué)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

C2C12小鼠成肌細(xì)胞來源于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection，ATCC)，細(xì)胞形態(tài)貼壁，保管條件為90%FBS(胎牛血清，fetal bovine serum)+10%DMSO（二甲基亞砜，Dimethyl sulfoxide）中液氮凍存，在37℃，5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中無菌恒溫培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇采用雄性SD大鼠，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，周齡為8-10周，體質(zhì)量150±10 g。飼育條件：動(dòng)物房溫度24℃，相對(duì)濕度50-60%，外周做隔音處理，正常環(huán)境噪音小于80分貝，24小時(shí)循環(huán)通風(fēng)換氣，光周期的控制為12小時(shí)(明)/12小時(shí)(暗)，解剖實(shí)驗(yàn)操作前禁食12小時(shí),自由飲水。

選用的鐵皮石斛原料購(gòu)于北京云中子商貿(mào)有限公司，原產(chǎn)于云南省普洱市。石斛水提取物提取工藝為，首先使用粉碎機(jī)將鐵皮石斛進(jìn)行粉碎處理，按照料液比1∶30,80±10℃熱水浸出1小時(shí)后，使用雙層醫(yī)用紗布進(jìn)行過濾處理，濾渣保留，按照1∶30、1∶20、1∶10的料液比反復(fù)熱水浸出3次，之后將全部濾液合并后做離心處理，取上清液；減壓濃縮至原液體積的1/6-1/8后，放入冰箱-20℃冷凍處理；使用真空冷凍干燥機(jī)對(duì)冷凍后的濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得到干燥鐵皮石斛提取物，含水率低于2.5%，產(chǎn)率為15-20%。實(shí)驗(yàn)用主要藥品和試劑：EGFR抗體（CellSignalingTechnology）、抗壞血酸（維生素C）[6]（阿拉?。?、乙腈（美國(guó)TEDIA）、三氟乙酸（德國(guó)MERCK）、鹽酸（阿拉?。溲趸c（阿拉?。?。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及劃痕實(shí)驗(yàn)

在細(xì)胞培養(yǎng)板中將C2C12細(xì)胞接種,先使用含10%牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，至60-70%細(xì)胞出現(xiàn)匯合后,倒掉培養(yǎng)液,使用PBS進(jìn)行2次清洗，然后加入含2%馬血清的DMEM分化培養(yǎng)液進(jìn)行分化,體外分化培養(yǎng)C2C12細(xì)胞5天后，進(jìn)行饑餓后加鐵皮石斛提取物處理，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組和不同濃度鐵皮石斛提取物組，濃度分別為20、40、80、160 ug?mL-1。處理后提取細(xì)胞蛋白，用于Western blot分析。

劃痕實(shí)驗(yàn)前，確認(rèn)每板細(xì)胞計(jì)數(shù)為2.5×107個(gè)。在培養(yǎng)皿中用無菌槍頭在每板內(nèi)沿圓心畫一條“一”字，將其分為均勻的兩個(gè)部分，劃線筆直無傾斜。并在培養(yǎng)皿底部作上分區(qū)標(biāo)記，以便拍照觀察。使用磷酸緩沖鹽溶液沖洗一遍培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞，去除劃痕劃下的細(xì)胞。此時(shí)記為0 h，在顯微鏡下觀察細(xì)胞情況并拍照，拍照完成后，進(jìn)行加藥處理，并將培養(yǎng)皿放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)2 h后于顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并拍照[7-9]。

1.2.2 骨骼肌孵育及處理

對(duì)大鼠進(jìn)行頸椎脫位處理后，將其肌肉迅速平緩地從體內(nèi)取出。肌肉的兩端用縫合線捆綁，固定在孵育裝置上，靜息張力設(shè)定為0.5 g，肌肉在7 mL Krebs Ringer碳酸氫鹽緩沖液（KRB）中預(yù)孵育30分鐘，向緩沖液持續(xù)通入95%O2-5%CO2的混合氣體，并保持溫度在37℃。首先進(jìn)行30分鐘預(yù)孵育，目的是消除手術(shù)過程中對(duì)肌肉組織本身直接進(jìn)行物理接觸刺激帶來的應(yīng)激性變化，使肌肉組織內(nèi)各生理水平盡量恢復(fù)到接近于在體內(nèi)的正常狀態(tài)。預(yù)孵育結(jié)束后，之后將肌肉在含有指定濃度鐵皮石斛提取物的7 mL新鮮緩沖液中孵育30分鐘，以檢測(cè)目標(biāo)試劑對(duì)大鼠離體肌肉的刺激效果。然后，刺激后肌肉組織立即凍結(jié)保存，用于Western blot分析[10]。

1.2.3 Western Blot檢測(cè)

對(duì)凍存的細(xì)胞樣本和肌肉組織樣本進(jìn)行，進(jìn)行BCA蛋白定量，在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上配制8%的凝膠，根據(jù)蛋白定量結(jié)果加樣本量，121 V恒壓電泳90 min。轉(zhuǎn)膜到聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜，5%BSA封閉1 h。1∶1000稀釋蛋白抗體（一抗），封閉后加入一抗4℃搖床過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗膜3次，每次10 min，再在封閉液中加入二抗(1∶5000-10000辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠抗體)，室溫1.5 h。再用PBST洗膜3次，每次10 min?；瘜W(xué)發(fā)光試劑顯色，曝光機(jī)中進(jìn)行曝光。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件ANOVA進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05有顯著性差異，P＜0.01有明顯顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛水提物對(duì)C2C12細(xì)胞遷移率的影響

圖1 鐵皮石斛水提物對(duì)C2C12細(xì)胞遷移率的影響

C2C12細(xì)胞在經(jīng)過不同濃度鐵皮石斛水提物2 h處理后，鐵皮石斛水提物（80 ug·mL-1）組的細(xì)胞遷移率明顯上升（圖1.F），與空白對(duì)照組相比有顯著性差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。鐵皮石斛水提物40ug·mL-1及160 ug·mL-1組的細(xì)胞遷移率略高于空白對(duì)照組，但差異不明顯（圖1.D、H）。綜上所訴，鐵皮石斛水提物在處理細(xì)胞2小時(shí)對(duì)細(xì)胞的遷移效果有一定的促進(jìn)效果，此效果與鐵皮石斛水提物的濃度有關(guān)。

圖2 鐵皮石斛提取物處理2 h后C2C12細(xì)胞中EGFR中蛋白表達(dá)的影響

2.2 鐵皮石斛水提物對(duì)C2C12細(xì)胞EGFR表達(dá)量的影響

EGFR是一種糖蛋白，屬于ErbB受體家族的一種，為酪氨酸激酶型受體。廣泛分布于哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面，EGFR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的作用。因此，我們利用蛋白免疫印跡法對(duì)C2C12細(xì)胞中EGFR蛋白表達(dá)進(jìn)行分析[11]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)鐵皮石斛提取物處理后C2C12細(xì)胞中EGFR與對(duì)照組相比有顯著上升(圖2)。這個(gè)結(jié)果說明，鐵皮石斛提取物能夠有效調(diào)控EGFR蛋白的表達(dá)，從而起到促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖的作用。

2.3 鐵皮石斛水提物對(duì)骨骼肌組織EGFR表達(dá)量的影響

為了進(jìn)一步研究鐵皮石斛水提物能否增加骨骼肌組織中EGFR表達(dá)水平，利用骨骼肌組織離體孵育實(shí)驗(yàn)體系（圖3），我們用含有鐵皮石斛水提物的緩沖液對(duì)骨骼肌組織進(jìn)行孵育處理，通過實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，骨骼肌組織經(jīng)過鐵皮石斛水提物處理后其EGFR表達(dá)量顯著上調(diào)（圖4）。

3 討論與結(jié)論

圖3 骨骼肌組織離體孵育實(shí)驗(yàn)體系示意圖

圖4 鐵皮石斛提取物處理后骨骼肌組織中EGFR中蛋白表達(dá)的影響

伴隨著全面健康熱潮，體育愛好者和廣大健身群體在從事體育鍛煉和運(yùn)動(dòng)的過程中很容易忽視對(duì)鍛煉的強(qiáng)度與時(shí)間的把控，不規(guī)范的運(yùn)動(dòng)方式及過度長(zhǎng)時(shí)間體育運(yùn)動(dòng)都會(huì)導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)性疲勞和骨骼肌損傷，此類問題已經(jīng)日益成為運(yùn)動(dòng)生理學(xué)、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)以及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練學(xué)界研究的熱點(diǎn)。同時(shí)，因?yàn)楣趋兰〉钠诤蛽p傷表觀上無法準(zhǔn)確評(píng)估和實(shí)施醫(yī)療對(duì)策，所以研究而的熱點(diǎn)也是一個(gè)難點(diǎn)，運(yùn)動(dòng)性疲勞及損傷問題主要以肌肉疲勞及損傷為主，而在體育運(yùn)動(dòng)中骨骼肌作為軀干和四肢的主要?jiǎng)訂T肌群，其疲勞以及損傷的問題極其常見，同時(shí)也非常關(guān)鍵。骨骼肌一旦發(fā)生了運(yùn)動(dòng)性疲勞和損傷，會(huì)造成人體機(jī)體的運(yùn)動(dòng)支持器官不能有效和穩(wěn)定的支持其機(jī)能維持在正常水平上，嚴(yán)重影響了對(duì)象人群的生活質(zhì)量和健康預(yù)期。特別是因疲勞形成損傷的肌肉組織如果不能得到有效的恢復(fù)，會(huì)直接導(dǎo)致肌肉收縮速度緩慢，效率降低，缺乏正常的伸展與收縮能力。這會(huì)造成從事運(yùn)動(dòng)人員的動(dòng)作不規(guī)范，整體不協(xié)調(diào)不連貫，誘發(fā)肌肉二次損傷概率大大升高。同時(shí)，運(yùn)動(dòng)損傷所帶來的不適感與疼痛感也給人們?nèi)粘Ｉ詈凸ぷ鲙砹藰O大的不便，這也會(huì)直接挫傷廣大群眾參與大眾體育活動(dòng)與全民健身的積極性和熱情。所以，除了積極普及大眾體育項(xiàng)目與指導(dǎo)群眾運(yùn)動(dòng)技能之外，通過有針對(duì)性的科學(xué)研究，利用各種有效手段及時(shí)補(bǔ)充損失的機(jī)能，使運(yùn)動(dòng)所帶來的骨骼肌損傷能夠快速恢復(fù)，增強(qiáng)體育運(yùn)動(dòng)的健康促進(jìn)效果與質(zhì)量，提高人民群眾的整體身體健康水平，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外運(yùn)動(dòng)生理學(xué)和運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)學(xué)者與社會(huì)指導(dǎo)員們關(guān)注的焦點(diǎn)之一。近年來科學(xué)應(yīng)用天然植物成分的功效性來預(yù)防骨骼肌疲勞、促進(jìn)損傷恢復(fù)，增強(qiáng)肌肉力量和柔韌性，增加肌肉耐力，提高協(xié)調(diào)控制機(jī)體各運(yùn)動(dòng)部分的能力，從而使人民身體強(qiáng)健成為一個(gè)熱門課題。近些年，世界上很多科研人員和知名制藥企業(yè)都在努力嘗試研究開發(fā)具有抗疲勞、促損傷恢復(fù)以及抗衰老功效的藥物和保健食品，但目前尚未有特別有效的藥物問世。另一方面，傳統(tǒng)中藥越來越受重視，并且有許多藥物都表現(xiàn)出有良好的抗疲勞、促損傷恢復(fù)和抗衰老的效果。大部分的藥物都有抗氧化、促新生的成分，具有清除因疲勞或老化導(dǎo)致的代謝異常產(chǎn)生過量副產(chǎn)物自由基的功能[12]。

因此，在推進(jìn)全民參與體育運(yùn)動(dòng)的大背景之下，針對(duì)肌肉疲勞和肌肉拉傷等常見的運(yùn)動(dòng)損傷形式，需要一種安全并有效的方法來緩解和抑制此類情況的發(fā)生。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、生活水平的提高和老齡化社會(huì)的到來，亞健康問題越來越嚴(yán)重，人們對(duì)養(yǎng)生保健的關(guān)注度也在逐漸增加，對(duì)保健食品的需求也愈加旺盛[13,14]。現(xiàn)在，鐵皮石斛保健食品功能中以增強(qiáng)免疫和緩解體力疲勞進(jìn)而擁有較高的知名度和市場(chǎng)占有率，得到消費(fèi)者的普遍認(rèn)可。深度研究鐵皮石斛功效機(jī)理，明確其功效機(jī)制，針對(duì)運(yùn)動(dòng)人群和亞健康人群的不同需求，開發(fā)出具有針對(duì)性的保健食品，可以開拓鐵皮石斛保健食品未來發(fā)展的新空間。

當(dāng)前世界推崇綠色食品、綠色運(yùn)動(dòng)，提倡綠色健康的生活方式，但是運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的肌肉損傷問題一直是人們不可回避的難題，本實(shí)驗(yàn)明確一定濃度的鐵皮石斛水提物能夠上調(diào)C2C12細(xì)胞和肌肉組織中EGFR的表達(dá)水平，并能促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖，這個(gè)研究發(fā)現(xiàn)在健康問題備受關(guān)注的現(xiàn)代，很可能成為解決運(yùn)動(dòng)引起的肌肉損傷問題的一個(gè)契機(jī)和重要線索[15-17]。

中醫(yī)藥越來越受到國(guó)際的普遍認(rèn)可，而中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)保健食品也必將成為未來國(guó)際市場(chǎng)的熱點(diǎn)。下一步，我們將繼續(xù)深入開展鐵皮石斛活性成分及相關(guān)功能的基礎(chǔ)研究，目標(biāo)定位于開發(fā)出具有明確功效成分、確切功效靶點(diǎn)的相關(guān)產(chǎn)品，使鐵皮石斛相關(guān)保健產(chǎn)品得到越來越多國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的青睞。