金 晶，王 晶，姚梓平，李風(fēng)森＊＊

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 烏魯木齊 830054；3.新疆維吾爾自治區(qū)呼吸病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 烏魯木齊 830000）

慢性阻塞性肺疾?。–hronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一種反復(fù)發(fā)作的氣道慢性炎癥性疾病。酪氨酸蛋白激酶/信號(hào)傳導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus Kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription，JAK/STAT）信號(hào)通路已被證實(shí)廣泛參與于COPD病理過(guò)程中細(xì)胞炎癥及免疫應(yīng)答[1]。近年來(lái)中藥復(fù)方通過(guò)多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)協(xié)同干預(yù)的優(yōu)勢(shì)，能夠有效改善COPD患者的臨床癥狀[2]。益氣固表丸（制劑號(hào)：ZJ20130098，國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利號(hào)：201410536529.5）由黨參、炒白術(shù)、茯苓、陳皮、法半夏、生薏苡仁、浮小麥、紫蘇子、蜜款冬花、黃芩、伊貝母、蜜枇杷葉、防風(fēng)共13味中藥組成[3]，是新疆維吾爾自治區(qū)某三甲醫(yī)院治療COPD等肺系病癥的常用復(fù)方制劑，自2004年以丸劑形式投入臨床以來(lái)能夠有效改善患者咳嗽痰多，汗出易感等癥狀[4,5]。本研究通過(guò)分析益氣固表丸對(duì)COPD模型大鼠治療前后JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān)炎性因子表達(dá)的影響，探討其治療COPD有效性的可能機(jī)制，為中西醫(yī)結(jié)合治療COPD探尋新途徑。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（新）2011-0004，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號(hào)SCXK（新）2011-0001]的SPF級(jí)鼠齡8周的雄性Wistar大鼠60只。飼養(yǎng)環(huán)境模擬自然晝夜條件，溫度（21±2）℃，濕度40%-50%，自由飲水，正常飲食，體質(zhì)量約（200 ± 50）g。

1.2 試驗(yàn)用藥

益氣固表丸購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院中心藥房（新疆制藥廠，批號(hào)20121212），脂多糖（LPS，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：L-2880），雪蓮過(guò)濾嘴香煙（新疆卷煙廠，烤煙型，焦油量13 mg煙氣煙堿量1.1 mg煙氣一氧化碳量13 mg），大鼠IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt ELISA試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，批號(hào)均為：GR201604-1），Platinum SYBR Green qPCR Super-Mix-UDG試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：C11733-038），Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：15596-026），M-MLV First-Strand Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：C28025-032），RT-PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 試驗(yàn)儀器

試驗(yàn)動(dòng)物煙熏箱（自制，大小60cm×50cm×40cm），Wistar大鼠全身暴露型無(wú)創(chuàng)肺功能檢測(cè)儀（型號(hào)：PLY3211，美國(guó)Buxco Electronics公司），電子高清顯微鏡（型號(hào)：U-CMAD3，日本Olympus公司），全自動(dòng)圖像分析儀（型號(hào)：U-CMAD3，日本Olympus公司），Thermal cycler深孔PCR儀（型號(hào)：C1000，美國(guó)BIO-RAD公司），全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（型號(hào)：Multiskan Spectrum，德國(guó)Thermo公司）。

1.4 COPD動(dòng)物模型造模

模型組及益氣固表丸組大鼠（n=40）放置于動(dòng)物煙熏箱內(nèi)，給予被動(dòng)熏煙，煙霧濃度450-500 bpm，30 min/次，間隔3 h/次，12 h更換煙盒1次，同時(shí)氣管內(nèi)滴注LPS 0.2 mg·kg-1，共計(jì)84天。并于大鼠造模第一天和最后一天，檢測(cè)大鼠體質(zhì)量，采用Wistar大鼠肺功能儀檢測(cè)大鼠肺功能指標(biāo)：吸氣峰流速（PIF）、呼氣峰流量（PEF）和每分鐘通氣量（MV），與空白組大鼠比較，下降幅度大于30%即為造模成功[6]。

1.5 試驗(yàn)方案

大鼠按照隨機(jī)數(shù)字原則分為3組，分別為：空白組（n=20）、模型組（n=20）、益氣固表丸組（n=20）。按照人與動(dòng)物間體表面積折算等效劑量公式折算出試驗(yàn)用大鼠的每日灌藥量（513 mg·kg-1），空白組及模型組大鼠每日予0.9%生理鹽水6.6 mL灌胃，益氣固表丸組給予益氣固表丸水溶液6.6 mL灌胃，每日兩次，所有的大鼠在給藥期間喂食正常飲食，灌胃84天，處死各組大鼠，取外周血及肺組織進(jìn)行分析。

表1 JAK1、JAK3、STAT1及STAT3引物序列表

1.6 病理標(biāo)本的制作

垂直于支氣管的肺矢狀面最大周徑處取材，取厚約5 mm的取各組大鼠左肺組織，剪成面積為1.5 cm2左右的小塊，浸入2 mL 4%多聚甲醛溶液中固定，使用PBS緩沖液洗滌，并浸泡于固定劑中至少24 h以上。甲醛固定后，石蠟包埋，將標(biāo)本切為3-4μm并加工用于HE染色。

1.7 外周血IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt水平的ELISA檢測(cè)

取各組大鼠外周血2 mL，離心3 000 rpm，10 mins，取血清保存于EP管置于-80℃冰箱保存，檢測(cè)時(shí)根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，于設(shè)置450 nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀上機(jī)檢測(cè)并計(jì)算IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt水平。

1.8 肺組織JAK1、JAK3、STAT1及STAT3 mRNA的RT-PCR檢測(cè)

依據(jù)Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取各組大鼠右肺組織總RNA，PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并擴(kuò)增目的基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，反應(yīng)總體系為25μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳確定其完整性，拍照并讀取灰度值，分析JAK1、JAK3、STAT1及STAT3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化情況（表1）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

圖1 大鼠肺組織HE染色結(jié)果（×200）

所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。Pearson法相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)照組：支氣管結(jié)構(gòu)及肺泡結(jié)構(gòu)清晰。支氣管未見(jiàn)明顯收縮，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道上皮排列整齊，管腔規(guī)則。模型組：支氣管及肺泡組織結(jié)構(gòu)紊亂，部分結(jié)構(gòu)消失。支氣管粘膜可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管出現(xiàn)收縮的現(xiàn)象，管腔變窄，氣道上皮排列不整齊，甚至出現(xiàn)斷裂的情況。益氣固表丸組：較模型組的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕；支氣管收縮好轉(zhuǎn)；管腔變窄改善，管腔直徑變寬（圖1）。

正常組（A），模型組（B）和益氣固表丸組（C）提示肺結(jié)構(gòu)的組織學(xué)改變。模型組大鼠肺組織（箭頭所示）主支氣管結(jié)構(gòu)紊亂和消失，存在廣泛浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞，支氣管顯示狹窄和痙攣狀態(tài)，以及不規(guī)則和破裂的氣道上皮（B）；益氣固表丸組大鼠肺組織（箭頭所示）顯示使用益氣固表丸等量水溶液干預(yù)后炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕；支氣管痙攣狀態(tài)好轉(zhuǎn)（C）。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定結(jié)果

與空白組比較，模型組IFN-γ水平降低（P＜0.05），IL-17a、IL-23及RORγt水平升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），益氣固表丸組IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt水平升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），與模型組比較，益氣固表丸組IL-17a、IL-23、RORγt水平下降（P＜0.05），IFN-γ水平升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

2.3 實(shí)時(shí)-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）定量檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，模型組及益氣固表丸組JAK1、JAK3、STAT1及STAT3 mRNA水平均升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與模型組比較，益氣固表丸組JAK1、JAK3、STAT1及STAT3 mRNA均降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）（表3，圖2）。

通過(guò)RT-PCR分析JAK/STAT通路中基因表達(dá)（A）為JAK1擴(kuò)增曲線，（B）為JAK3擴(kuò)增曲線，（C）為STAT1擴(kuò)增曲線，（D）為JAK1擴(kuò)增曲線，（E）為JAK1溶解曲線，（F）為JAK3溶解曲線，（G）為STAT1溶解曲線，（H）為STAT3溶解曲線

2.4 JAK1、JAK3、STAT1、STAT3 與 IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt的相關(guān)性分析

JAK1、JAK3、STAT1及STAT3與IL-17a顯著相關(guān)（P＜ 0.01），JAK1、JAK3、STAT1及STAT3與IL-23相關(guān)（P＜ 0.05），JAK1與IFN-γ呈負(fù)相關(guān)（P＜ 0.05），JAK3、STAT1與STAT3與IFN-γ無(wú)相關(guān)（P＞0.05），JAK1、JAK3、STAT1及 STAT3與 RORγt無(wú)相關(guān)（P＞ 0.05）（表4）。

3 討論

氣道炎癥反應(yīng)的持續(xù)狀態(tài)是COPD過(guò)程中重要的病理狀態(tài)[7]。JAK/STAT通路的激活與炎癥因子的表達(dá)密切相關(guān)，多種細(xì)胞因子如干擾素受體家族（IFN-γ）以及白介素受體家族（白細(xì)胞介素IL-17a、IL-23）等，通過(guò)激活JAK/STAT通路，在COPD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮的重要作用[8,9]。中醫(yī)藥通過(guò)調(diào)控STAT通路防治COPD的研究，逐漸顯示出較大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景，許光蘭等[10]證實(shí)清金化痰顆粒能夠抑制IL-6的水平的升高，下調(diào)JAK/STAT信號(hào)通路中STAT1，STAT3的過(guò)度表達(dá)和持續(xù)活化，從而減輕氣道炎癥，抑制COPD急性發(fā)作與加重。Wang C[11]發(fā)現(xiàn)六味補(bǔ)氣膠囊可有效抑制JAK/STAT通路活性，明顯提高了肺氣虛型COPD穩(wěn)定期患者的生活質(zhì)量和肺功能。

熊斌等[12]認(rèn)為“脾虛”對(duì)免疫功能的影響與JAK/STAT通路異常表達(dá)有關(guān)。因此，考慮能否通過(guò)中醫(yī)的健脾的治法以改善免疫功能的異常，是現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合證治研究的關(guān)注點(diǎn)，益氣固表丸是建立在“培土生金”治則上針對(duì)臨床肺脾氣虛證COPD相關(guān)病癥患者的復(fù)方制劑，方中黨參具有補(bǔ)中益氣，健脾益肺之功效，為方中之君藥，能夠健運(yùn)脾氣之大統(tǒng)，輔以白術(shù)、茯苓，淡滲利濕以醒脾，薏苡仁利濕健脾，半夏、陳皮以行“二陳湯”之理氣和中兼燥濕之功效，脾氣得充則有化濕之力，浮小麥滋陰斂汗而清肺之虛熱，以防子（肺）火乘母（脾）臟，防風(fēng)入肝脾經(jīng)，以祛風(fēng)勝濕固表，余藥以清利肺氣，諸藥共參，多種藥物綜合起效達(dá)到共奏“抑炎抗氧化”之效。本次研究通過(guò)益氣固表丸的干預(yù)，研究JAK/STAT通路的活性，是本次研究的目的，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型大鼠外周血及肺組織中，炎性因子如：白細(xì)胞介素（IL-17a、IL-23）、RORγt水平升高，IFN-γ水平下降，STAT1、STAT3 mRNA表達(dá)顯著高于正常組，IL-17a及IL-23是T淋巴細(xì)胞亞群的下游產(chǎn)物，考慮IL-17a及IL-23的升高與Th17Treg亞群失衡有關(guān)，提示COPD的病情進(jìn)展與JKA/STAT通路的持續(xù)活化與其下游炎癥蛋白過(guò)度表達(dá)密切相關(guān)，益氣固表丸干預(yù)后可使上調(diào)的IL-17a、IL-23及RORγt水平下降，升高下調(diào)的 IFN-γ水平，同時(shí)升高 JAK1、JAK3、STAT1及STAT3 mRNA的表達(dá)，起到抑制JAK/STAT通路活性的作用，下一步的研究將通過(guò)研究T淋巴細(xì)胞亞群失衡情況，以了解JAK/STAT通路與Th17Treg比例的關(guān)系，以及相關(guān)中藥對(duì)通路及淋巴細(xì)胞亞群的影響。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)JAK1、JAK3、STAT1、STAT3的mRNA表達(dá)與IL-17a、IL-23成正相關(guān)，JAK1、JAK3與IFN-γ呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步證明IL-17a和IL-23具有強(qiáng)大的致炎性，是聯(lián)系T細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的重要介質(zhì)，能夠激活JAK/STAT通路，進(jìn)一步肯定了炎性細(xì)胞因子在COPD病變過(guò)程中的作用。

表2 各組大鼠外周血IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt水平的比較/ng·mL-1（ˉ± s）

表2 各組大鼠外周血IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt水平的比較/ng·mL-1（ˉ± s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組相比，P＜0.05。

RORγt 8.49±0.45 36.41±2.34*20.09±1.84*△520.013＜0.001分組空白組模型組益氣固表丸組F P IL-17a 14.36±0.94 89.91±0.94*53.08±2.95*△1627.6＜0.001 IL-23 30.90±3.96 74.21±4.91*54.93±5.09*△172.165＜0.001 INF-γ 65.06±1.81 49.63±3.12*55.32±1.58*△94.405＜0.001

表3 各組大鼠肺組織JAK1、JAK3、STAT1及STAT3的比較/ng·mL-1（±s）

表3 各組大鼠肺組織JAK1、JAK3、STAT1及STAT3的比較/ng·mL-1（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組相比，△P＜0.01。

STAT3 1.0±0.0 4.21±1.82*2.08±0.97*△11.267 0.001空白組模型組益氣固表丸組F P JAK1 1.0±0.0 5.05±2.50*0.89±0.43*△15.76＜0.001 JAK3 1.0±0.0 4.08±0.97*3.13±0.71*△30.386＜0.001 STAT1 1.0±0.0 5.93±2.30*1.72±0.89*△20.932＜0.001

表4 JAK1、JAK3、STAT1及STAT3與IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt的相關(guān)性分析/ng·mL-1

圖2 JAK1、JAK3、STAT1及STAT3RT-PCR圖形

4 結(jié)論

COPD模型大鼠肺組織中JAK/STAT通路處于激活狀態(tài)，益氣固表丸通過(guò)下調(diào)外周血中IL-23及IL-17a水平，升高IFN-γ水平，抑制肺組織中JAK/STAT通路中相關(guān)因子mRNA水平的表達(dá)，改善COPD模型大鼠氣道炎癥水平及病理學(xué)變化。