張敏佳，歐陽道福，王曉寧，劉文穎，劉偉，喻勤，周雅琳，許雅君, 5*，谷瑞增*

1(北京大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，北京，100191) 2(完美(中國)有限公司，廣東 中山，528402) 3(中國人民解放軍國防大學(xué) 聯(lián)合勤務(wù)學(xué)院，北京，100039) 4(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015) 5(食品安全毒理學(xué)研究與評價北京市重點實驗室，北京，100191)

發(fā)酵果蔬汁是指以一種或多種新鮮果蔬、菌菇和中草藥等為原料，經(jīng)多種或單一乳酸菌發(fā)酵而成的果蔬汁類飲料[1]。其利用微生物發(fā)酵萃取天然蔬果原料精華，濃縮了微生物代謝生成的有機酸、功能性低聚糖、多肽等功能成分。已有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵果蔬汁具有調(diào)節(jié)腸道菌群、提高免疫力、消除自由基等保健功效[2]。這類產(chǎn)品在日本和臺灣地區(qū)發(fā)展迅速，目前國內(nèi)的果蔬酵素市場也開始孕育和發(fā)展，但正規(guī)的產(chǎn)品及相關(guān)功能研究仍然較少[3]。本實驗的發(fā)酵果蔬汁樣品以常年種植，產(chǎn)量大，易儲藏的新鮮果蔬或未添加任何添加劑的干燥后的果實為主要原料，其他應(yīng)季蔬果為輔料，使用先進的高純度凍干直投式菌種，多菌株混合發(fā)酵，同時采用發(fā)酵促進技術(shù)和分步發(fā)酵技術(shù)，充分利用底物營養(yǎng)，富集對身體有益的發(fā)酵代謝物，酵素濃度高，含有豐富的有機酸、低聚糖、膳食纖維等。

便秘是臨床上常見的消化道癥狀，主要表現(xiàn)為排便減少(<3次/周)，糞便干硬和(或)排便困難[4]。根據(jù)產(chǎn)生原因，可分為先天性、原發(fā)性和繼發(fā)性便秘，原發(fā)性便秘即功能性便秘(functional constipation，F(xiàn)C)，是一類排除了器質(zhì)性病變的便秘癥狀。肥胖是指攝入的熱量遠大于消耗，造成體內(nèi)脂肪堆積致體質(zhì)量增加。肥胖不僅影響美觀，還伴隨一系列病癥如高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥等。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)改變，生活節(jié)奏加快，功能性便秘和肥胖已成為影響現(xiàn)代人生活質(zhì)量的重要病癥。目前，功能性便秘的藥物治療通常采用膨松藥、滲透性瀉藥、糞便軟化劑等[5]。但調(diào)查[6]顯示，47%的患者對于藥物治療滿意度差，且不同藥物的副作用也為患者帶來新的困擾；對于肥胖的干預(yù)方法主要有食療、運動、藥物和外科手術(shù)等，其中食療方法被認為是安全可靠且易接受的減肥方法之一。發(fā)酵果蔬汁富含有機酸、低聚糖、膳食纖維等，功能性便秘和肥胖都被證明與膳食纖維攝入較少有關(guān)。且已有大量研究表明，膳食纖維具有改善功能性便秘和肥胖的功能[7-13]。因此，本研究旨在建立功能性便秘和肥胖的實驗動物模型基礎(chǔ)上，探究發(fā)酵果蔬汁的通便和減肥功能，為開發(fā)利用發(fā)酵果蔬汁提供科學(xué)依據(jù)，為功能性便秘和肥胖的治療提供思路，改善肥胖人群的生活質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 受試物

本實驗所用發(fā)酵果蔬汁以17種新鮮果蔬或未添加任何添加劑的果蔬干制品或果蔬漿料為原料，采用現(xiàn)代生物發(fā)酵工藝制成，原料配比和膳食纖維含量分別見表1和表2。

表1 發(fā)酵果蔬汁原料配比

表2 發(fā)酵果蔬汁膳食纖維含量 單位：g/100g

1.2 試劑及儀器

鹽酸洛哌丁胺，規(guī)格為2 mg×6粒，西安楊森制藥有限公司，商品編碼: 02000553，批準文號:國藥準字H10910085；阿拉伯樹膠粉、活性炭粉，北京寶瑞杰科技有限公司。

小鼠灌胃針，大鼠灌胃針，手術(shù)剪，眼科鑷，直尺，1 mL注射器，電子天平(奧豪斯SPN3001F、賽多利斯BS2000S)。

1.3 實驗動物及飼養(yǎng)條件

SPF級健康雄性ICR小鼠，體重約18～22 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供，動物合格證號：SCXK(京)2016—0010，SPF級健康雄性SD大鼠，體重約160～200 g,由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供，動物合格證號：SCXK(京)2011—0012。動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2012—0011。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(23±2) ℃，濕度50%～60%，明暗交替12 h∶12 h。

1.4 通便功能評價實驗

1.4.1 實驗分組及受試樣品給予

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，稱量體重，按體重隨機分成5組，分別為空白對照組、模型對照組和3個劑量組，每組12只?？瞻讓φ战M和模型對照組經(jīng)口灌胃給予蒸餾水，3個劑量組相同途徑給予相應(yīng)濃度的發(fā)酵果蔬汁，連續(xù)給予受試物15 d。按照以上方法飼養(yǎng)相同的2批動物，分別進行小腸運動實驗和排便實驗。各組小鼠在整個實驗周期內(nèi)自由飲水、進食，具體實驗分組及受試樣品給予見表3。

表3 實驗分組及受試樣品給予

1.4.2 功能性便秘模型的建立

進行小腸運動實驗的動物在灌胃15 d后，各組小鼠禁食不禁水16 h后，模型對照組和3個劑量組灌胃給予鹽酸洛哌丁胺(5 mg/kg BW)，空白對照組給予蒸餾水。進行排便實驗的動物鹽酸洛哌丁胺為10 mg/kg BW，其余處理同上。

1.4.3 指標測定

給鹽酸洛哌丁胺0.5 h后，發(fā)酵果蔬汁低、中、高劑量組分別灌胃給予含受試樣品的墨汁(含5%的活性炭粉、10%阿拉伯樹膠)，對照組給墨汁灌胃。

進行小腸運動實驗的動物在灌胃墨汁25 min后立即脫頸椎處死，打開腹腔分離腸系膜，剪取上端自幽門、下端至回盲部的腸管，置于托盤上，輕輕將小腸拉成直線，測量腸管長度為“小腸總長度”，從幽門至墨汁前沿為“墨汁推進長度”。按公式(1)計算墨汁推進率：

(1)

墨汁推進率需進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，X=Sin-1√P，式中P為墨汁推進率，用小數(shù)表示。

進行排便實驗的動物從灌胃墨汁開始，記錄每只動物排首粒黑便時間、5 h內(nèi)排黑便粒數(shù)，稱量糞便鮮重，并將其烘干至恒重，稱量糞便干重，按公式(2)計算糞便含水量：

(2)

1.5 減肥功能評價實驗

1.5.1 實驗分組及受試樣品給予

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，稱量體重，按體重隨機分成2組，10只大鼠給予維持飼料作為空白對照組，60只給予高熱量飼料作為模型對照組。每周記錄給食量、撒食量、剩食量，稱量體重1次。喂養(yǎng)2周后，給予高熱量飼料的大鼠按體重增重排序，淘汰體重增重較低的1/3肥胖抵抗大鼠。

將篩選出的40只肥胖敏感大鼠按體重隨機分成4組，分別為模型對照組和3個劑量組。模型對照組和3個劑量組給予高熱量模型飼料，上述空白對照組給予維持飼料。各劑量組灌胃給予不同劑量的受試樣品，模型對照組和空白對照組給予等量的相應(yīng)溶劑，受試樣品給予時間6周。具體實驗分組及受試樣品給予同表3。

1.5.2 指標測定

每周記錄給食量、撒食量、剩食量，稱量體重1次。喂養(yǎng)6周后，各組動物禁食不禁水過夜，第2天清晨稱量體重后在乙醚麻醉下經(jīng)股動脈放血處死。處死后的動物剖腹完整分離腎周及睪周脂肪并稱重，計算脂肪/體重值。

1.6 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果以X±SD(均數(shù)±標準差)表示。所有數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)對不同實驗組的結(jié)果進行統(tǒng)計檢驗，以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的判斷標準。方差齊時，采用LSD法進行兩兩比較；方差不齊時，采用Tamhane′s法進行兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 通便功能評價實驗結(jié)果

2.1.1 小腸運動實驗

小腸運動實驗期間各組動物未出現(xiàn)腹瀉癥狀，飲食和活動正常，健康狀況和精神狀況良好。發(fā)酵果蔬汁對小鼠體重的影響如表4所示。由表4可見，小腸運動實驗各組動物初始體重?zé)o明顯差異(P>0.05)；經(jīng)口灌胃給予受試物15 d后，各組動物終末體重也無明顯差異(P>0.05)。表明受試樣品發(fā)酵果蔬汁對動物的生長無不良影響。

表4 小腸運動實驗發(fā)酵果蔬汁對小鼠體重的影響(n=12)

小腸運動實驗結(jié)果如表5所示。與空白對照組相比，模型對照組墨汁推進率顯著降低(P<0.01)，說明使用鹽酸洛哌丁胺構(gòu)建小鼠便秘模型成功。與模型對照組相比，發(fā)酵果蔬汁劑量組小鼠的墨汁推進率均高于模型組，且隨劑量增大而更接近空白對照組，其中發(fā)酵果蔬汁中、高劑量組墨汁推進率顯著升高(P<0.05，P<0.01)，且與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明中、高劑量發(fā)酵果蔬汁可促進便秘模型小鼠的小腸蠕動。

表5 發(fā)酵果蔬汁對小鼠小腸運動的影響(n=12)

注：與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，#P<0.05，##P<0.01。

2.1.2 排便實驗

排便實驗期間各組動物未出現(xiàn)腹瀉癥狀，飲食和活動正常，健康狀況和精神狀況良好。發(fā)酵果蔬汁對小鼠體重的影響如表6所示。由表6可見，排便實驗各組動物初始體重?zé)o明顯差異(P>0.05)；經(jīng)口灌胃給予受試物15 d后，各組動物終末體重也無明顯差異(P>0.05)。表明受試樣品發(fā)酵果蔬汁對動物的生長無不良影響。

表6 排便實驗發(fā)酵果蔬汁對小鼠體重的影響(n=12)

排便實驗結(jié)果如表7所示。與空白對照組相比，模型對照組排首粒黑便時間顯著延長(P<0.01)，5 h排黑便粒數(shù)、5 h排黑糞便質(zhì)量均顯著減少(P<0.01)，說明使用鹽酸洛哌丁胺構(gòu)建小鼠便秘模型成功。與模型對照組相比，發(fā)酵果蔬汁低、中、高劑量組排首粒黑便時間均有不同程度的縮短，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見表7)，且存在劑量反應(yīng)關(guān)系，中、高劑量5 h排黑便粒數(shù)顯著增多(P<0.05，P<0.01)，表明發(fā)酵果蔬汁能縮短小鼠的首便時間，改善便秘癥狀。

與空白對照組相比，模型對照組糞便含水量無顯著差異(P>0.05)，說明本研究所用造模藥物對受試動物糞便含水量無顯著影響。與模型對照組相比，發(fā)酵果蔬汁劑量組糞便含水量無顯著差異(P>0.05)，但均有上升，且存在隨劑量增大糞便含水量增加的趨勢，提示發(fā)酵果蔬汁可能通過增加糞便含水量改善便秘癥狀，但要深入探討發(fā)酵果蔬汁對受試動物糞便含水量的影響尚需采用更合適的造模方法。

表7 發(fā)酵果蔬汁對小鼠排便時間、糞便粒數(shù)、糞便質(zhì)量和糞便含水量的影響(n=12)

注：與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 減肥功能評價實驗結(jié)果

2.2.1 實驗期間動物體重增長

實驗期間動物體重變化如表8所示，造模結(jié)束后，各組動物初始體重?zé)o明顯差異(P>0.05)。整個實驗期間，各組動物的平均體重均呈現(xiàn)隨周齡增加逐漸增加的趨勢。從第4周開始，B組體重顯著高于A組(P<0.05)，并一直延續(xù)至實驗結(jié)束(第5周，P<0.05；第6周，P<0.01)，提示肥胖模型建立成功。第1周，C組、E組體重顯著低于B組(P<0.05)。從第3周開始，E組體重顯著低于B組直至實驗結(jié)束(P<0.05)，提示一定劑量的發(fā)酵果蔬汁可降低肥胖大鼠體重。

表8 發(fā)酵果蔬汁對飼喂高熱量飼料大鼠體重的影響(n=10) 單位：g

注：與空白對照組(A組)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組(B組)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，#P<0.05。A-空白對照組；B-模型對照組；C-發(fā)酵果蔬汁低劑量組；D-發(fā)酵果蔬汁中劑量組；E-發(fā)酵果蔬汁高劑量組，下同。

2.2.2 實驗期間動物攝食量

實驗期間各組動物的攝食量如表9所示，各組動物攝食量無明顯差異(P>0.05)，提示發(fā)酵果蔬汁對實驗動物攝食行為無不良影響。

表9 發(fā)酵果蔬汁對飼喂高熱量飼料大鼠攝食量的影響(n=10) 單位：g

2.2.3 脂/體比

如表10所示，與A組相比，B、C、D組睪丸及腎周脂肪重顯著升高(P<0.05)，脂/體比也顯著增加(見表10)，提示肥胖模型建立成功。與B組相比，E組睪丸及腎周脂肪重和脂/體比均顯著降低(P<0.01)，提示一定劑量的發(fā)酵果蔬汁可降低肥胖大鼠體內(nèi)脂肪含量，有助于減肥。

表10 發(fā)酵果蔬汁對飼喂高熱量飼料大鼠脂/體比值的影響(n=10)

注：與空白對照組(A組)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，*P<0.05；與模型對照組(B組)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，##P<0.01。

3 結(jié)論與討論

發(fā)酵果蔬汁富含膳食纖維，便秘的產(chǎn)生與飲食結(jié)構(gòu)密切相關(guān),其中一個重要原因就是膳食纖維缺乏，已有研究[13-15]顯示肉蓯蓉膳食纖維、復(fù)合膳食纖維具有良好的潤腸通便功能，其重要機制之一是水不溶性膳食纖維具有較強的持水力，使糞便柔軟易于排出，同時具有一定的溶脹性，且不易被消化酵解，從而形成較多食物殘渣，使糞便的重量和體積增大利于排出[16]。此外，水溶性膳食纖維容易被腸道菌群酵解，產(chǎn)生丁酸、乙酸等短鏈脂肪酸(SCFA)，降低腸內(nèi)pH值，同時與酵解產(chǎn)物二氧化碳、甲烷等氣體共同刺激腸粘膜，也可促進腸道蠕動[16]。另一方面，膳食纖維的持水力使其能夠增加小腸內(nèi)容物的體積、容量和黏度，延緩人體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[12]，同時，還能夠調(diào)節(jié)胃腸道中相關(guān)激素的分泌來增加飽腹感，從而調(diào)控體重增長[17]。

本實驗使用鹽酸洛哌丁胺構(gòu)建小鼠功能性便秘模型，使用高熱量飼料構(gòu)建大鼠營養(yǎng)性肥胖模型，結(jié)果顯示模型構(gòu)建成功。同時，發(fā)酵果蔬汁組墨汁推進率、排首粒黑便時間和5h排黑便粒數(shù)與模型對照組相比有顯著改善；發(fā)酵果蔬汁組體重、睪丸及腎周脂肪重和脂/體比也顯著低于模型組，根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》，可判定本實驗所用發(fā)酵果蔬汁具有通便和減肥功能。本研究為開發(fā)利用發(fā)酵果蔬汁提供了科學(xué)依據(jù)，為功能性便秘和肥胖的治療提供了思路。