戶紅通, 徐達(dá), 徐慶陽(yáng)1,2,*,陳寧1,2,

1 (代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津,300457) 2 (天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津,300457) 3 (天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津,300457)

在氨基酸、有機(jī)酸以及抗生素等的發(fā)酵法生產(chǎn)中，菌體細(xì)胞膜的通透性大小對(duì)其產(chǎn)量有一定的影響，這其中尤以谷氨酸的生產(chǎn)最為重要[1]。谷氨酸產(chǎn)量的高低與否，在很大程度上取決于菌體細(xì)胞膜通透性的大小[2]。本研究以“生物素亞適量”型菌株為研究對(duì)象，生物素亞適量型谷氨酸生產(chǎn)菌具有生長(zhǎng)速度快、不易染菌等優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)存在著菌體轉(zhuǎn)型周期長(zhǎng)、產(chǎn)酸低的缺陷[3]。主要原因是細(xì)胞膜通透性低和相關(guān)酶活力過(guò)早下降。另外，從代謝途徑來(lái)看，由于生物素的限制作用，使得磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活力下降，CO2固定反應(yīng)減弱，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸受到抑制；而如果生物素供應(yīng)適量則菌體細(xì)胞膜的通透性將會(huì)極大降低，產(chǎn)酸將會(huì)嚴(yán)重下降。

超聲技術(shù)主要是利用超聲波能加速和控制化學(xué)反應(yīng)，提高化學(xué)產(chǎn)率，改變反應(yīng)歷程和改善反應(yīng)條件[4-5]。超聲波作為一種聲波，它具有特殊的能量作用形式，當(dāng)強(qiáng)度超過(guò)一定值時(shí)，會(huì)使媒質(zhì)的狀態(tài)、組分、結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生變化，超聲波所引起的空化泡崩潰時(shí)，在極短時(shí)間和極小空間產(chǎn)生瞬時(shí)高溫和高壓[6-7]，并伴有強(qiáng)烈的沖擊波和微射流，使細(xì)胞的膜脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)胞膜短時(shí)間內(nèi)局部破裂，從而改變細(xì)胞膜通透性[8-11]。當(dāng)超聲波應(yīng)用于谷氨酸發(fā)酵時(shí)，它不僅能夠加快菌體的物質(zhì)交換速率，提高酶促反應(yīng)速率以及增強(qiáng)菌體代謝強(qiáng)度，從而縮短發(fā)酵時(shí)間，改善生物反應(yīng)條件，更重要的是能夠較大提高細(xì)胞膜的通透性和選擇性，即使在生物素亞適量的條件下，也能進(jìn)一步提高細(xì)胞膜通透性，菌體內(nèi)的谷氨酸能得以及時(shí)分泌，并由此解除高濃度谷氨酸引起的反饋調(diào)節(jié)作用[12-14]。

因此，本研究將采用超聲輔助細(xì)胞轉(zhuǎn)型的谷氨酸發(fā)酵工藝，提高菌體細(xì)胞膜通透性，強(qiáng)化代謝途徑，實(shí)現(xiàn)谷氨酸高效生產(chǎn)[15]。本研究做到人為地改變細(xì)胞膜的通透性，這有利于代謝產(chǎn)物在細(xì)胞外的積累，使代謝按照人們希望的方向進(jìn)行，是實(shí)現(xiàn)代謝人工調(diào)控的重要方法之一，具有實(shí)際的意義[16]。

1 材料與方法

1.1 菌種

生物素亞適量型高產(chǎn)菌株(谷氨酸棒狀桿菌GDK-168)，由天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 活化斜面培養(yǎng)基

牛肉膏10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，玉米漿20.0 mL/L，瓊脂25.0 g/L，pH 7.0。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

口服葡萄糖25.0 g/L，玉米漿33.0 mL/L，豆餅水解液22.0 mL/L，K2HPO4·3H2O 2.2 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，蛋氨酸2.0 g/L。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

口服葡萄糖80.0 g/L，Na2HPO4·12H2O 3.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.8 g/L，KCl 1.7 g/L，蛋氨酸2.0 g/L，MnSO4·H2O 2.5 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.5 mg/L，VB10.5 mg/L，糖蜜1.0 g/L，玉米漿4.0 mL/L，豆餅水解液20.0 mL/L。

1.3 主要儀器

LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；MCGS 5 L不銹鋼機(jī)械攪拌發(fā)酵罐、MCGS 30 L不銹鋼機(jī)械攪拌發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司；超聲波發(fā)生器：邯鄲市海拓機(jī)械科技有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司；A300氨基酸分析儀：德國(guó)安米諾西斯公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 超聲波輔助細(xì)胞轉(zhuǎn)型的谷氨酸發(fā)酵工藝

在發(fā)酵罐中插入耐高溫超聲波探頭，在發(fā)酵開始之前可以隨罐滅菌，在發(fā)酵開始后，打開超聲波控制器，在一定的條件下(本儀器固定功率500 W，頻率20 kHZ，可調(diào)節(jié)不同振幅)進(jìn)行不同時(shí)間和間隔時(shí)間的超聲波處理，至發(fā)酵8 h停止超聲。具體超聲發(fā)酵裝置如圖1所示。

圖1 超聲輔助細(xì)胞轉(zhuǎn)型的谷氨酸發(fā)酵裝置圖

Fig.1 Ultrasonic assisted cell transformation of glutamic acid fermentation device

1.4.2 單因素試驗(yàn)

(1)超聲時(shí)間對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響。在超聲振幅為70%，間隔時(shí)間為10 min的條件下，對(duì)不同超聲時(shí)間(30、40、50、60、70 s)進(jìn)行研究，獲取最佳超聲時(shí)間。

(2)振幅對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響。在最佳超聲時(shí)間，間隔時(shí)間為10 min的條件下，對(duì)不同超聲振幅(55%、60%、65%、70%、75%)進(jìn)行研究，獲得最佳超聲振幅。

(3)間隔時(shí)間對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響。在最佳超聲振幅，最佳超聲時(shí)間的條件下，對(duì)不同間隔時(shí)間(4、6、8、10、12 min)進(jìn)行研究，確定最佳間隔時(shí)間。

1.4.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定實(shí)驗(yàn)因素，超聲時(shí)間、超聲振幅和間隔時(shí)間的最佳值分別為50 s、65%和6 min。以O(shè)D值、谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo)，選用L9(34)正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，對(duì)超聲輔谷氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵影響因素進(jìn)行研究。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 超聲波輔助谷氨酸發(fā)酵正交試驗(yàn)因素水平表

1.5 檢測(cè)分析方法

1.5.1 谷氨酸產(chǎn)量及發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定

見參考文獻(xiàn)[17]和[18]。

1.5.2 有機(jī)酸及氨基酸的測(cè)定

使用高效液相色譜分析儀進(jìn)行發(fā)酵液中有機(jī)酸的檢測(cè)，應(yīng)用氨基酸分析儀測(cè)定發(fā)酵液中氨基酸的含量。

1.5.3 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)助手對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響

在超聲振幅為70%，間隔時(shí)間為10 min的條件下，不同超聲時(shí)間對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響如圖2所示。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響

Fig.2 Effect of ultrasound time on glutamic acid fermentation

可以看出隨著超聲時(shí)間的增加，OD值、谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。當(dāng)連續(xù)超聲時(shí)間超過(guò)50 s后，三者開始下降，尤其是谷氨酸產(chǎn)量快速降低。分析可知，適當(dāng)時(shí)長(zhǎng)的超聲處理可以加快菌體的酶活力，提高菌體生長(zhǎng)速度和細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而提高了谷氨酸的分泌和糖酸轉(zhuǎn)化率[19]。但是當(dāng)連續(xù)超聲時(shí)間太長(zhǎng)，勢(shì)必會(huì)對(duì)菌體造成一定程度的損傷，不但會(huì)降低菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸速率，而且也會(huì)出現(xiàn)抑制作用。選擇最佳的超聲時(shí)間才能達(dá)到良好的效果，因此選取50 s作為連續(xù)超聲時(shí)間。

2.1.2 超聲振幅對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響

在超聲時(shí)間為50 s，間隔時(shí)間為10 min的條件下，不同超聲振幅對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響如圖3所示。可以明顯的看出，在超聲振幅低于65%時(shí)，OD值、谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率不斷增加，超聲振幅高于65%后，三者明顯下降。分析可知，超聲振幅太低并不能提高菌體生長(zhǎng)速度和產(chǎn)酸速率，而過(guò)高的超聲振幅會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生較大的損害，降低菌體活力，不利于菌體生長(zhǎng)和谷氨酸合成。也因此選擇65%作為最佳超聲振幅。

圖3 超聲振幅對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響

Fig.3 Effect of ultrasonic amplitude on glutamic acid fermentation

2.1.3 間隔時(shí)間對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響

在超聲時(shí)間為50 s，超聲振幅為65%的條件下，不同超聲間隔時(shí)間對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響如圖4所示。從圖中可以看出，超聲時(shí)間間隔對(duì)OD值、谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的影響是很明顯的。間隔時(shí)間(4 min)太短，也就是超聲強(qiáng)度較大，對(duì)菌體的損害比較嚴(yán)重，不但沒(méi)能促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和谷氨酸分泌，反而有一定程度的抑制作用。隨著間隔時(shí)間(6 min)的增加，超聲強(qiáng)度適宜，OD值、谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率都得到了提升。而間隔時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，雖然OD值的增長(zhǎng)少許降低，但是對(duì)細(xì)胞膜的損傷效果太低，又由于菌體自身的細(xì)胞膜修復(fù)功能，因此細(xì)胞膜的通透性并未得到提高，因此谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率不斷下降。故選擇6 min作為最佳超聲間隔時(shí)間。

圖4 間隔時(shí)間對(duì)谷氨酸發(fā)酵的影響

Fig.4 Effect of interval time on glutamic acid fermentation

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

據(jù)表1所設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 超聲波輔助谷氨酸發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由正交試驗(yàn)結(jié)果和極差(R)分析可知，對(duì)于OD值的影響次序?yàn)锳>B>C，即超聲時(shí)間>振幅>間隔時(shí)間，最佳條件為A2B2C3，即超聲時(shí)間50 s、振幅65%、間隔時(shí)間7 min；對(duì)谷氨酸產(chǎn)量的影響次序?yàn)锽>A>C，即振幅>超聲時(shí)間>間隔時(shí)間，最佳條件為A2B2C1，即超聲時(shí)間50 s、振幅65%、間隔時(shí)間5 min；對(duì)糖酸轉(zhuǎn)化率的影響次序?yàn)锽>A>C，即振幅>超聲時(shí)間>間隔時(shí)間，最佳條件為A2B2C1，即超聲時(shí)間50 s、振幅65%、間隔時(shí)間5 min。另一方面，由方差分析可知，超聲時(shí)間和振幅不僅對(duì)OD值有顯著影響，而且對(duì)谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率也有顯著影響；而間隔時(shí)間只對(duì)OD值有影響顯著。綜合考慮以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在既滿足一定量OD值的同時(shí)，又能提高谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，因此最佳超聲條件選擇A2B2C1，即超聲時(shí)間50 s、振幅65%、間隔時(shí)間5 min。

表3 方差分析

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

依據(jù)正交試驗(yàn)所得最佳超聲條件，進(jìn)行3批次平行發(fā)酵驗(yàn)證，所得試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

A-對(duì)照發(fā)酵的OD值；C-谷氨酸產(chǎn)量；E-糖酸轉(zhuǎn)化率;B-最佳超聲條件發(fā)酵的OD值;D-谷氨酸產(chǎn)量;F-糖酸轉(zhuǎn)化率

圖5 最佳超聲條件發(fā)酵與對(duì)照發(fā)酵的對(duì)比

Fig.5 Comparison between optimal ultrasonic condition fermentation and control fermentation

由圖5分析可知，無(wú)論是OD值，還是谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，超聲發(fā)酵都比對(duì)照發(fā)酵有一定程度的提升。對(duì)照發(fā)酵的開始產(chǎn)酸時(shí)間(即谷氨酸菌體開始完成由谷氨酸非積累型菌體向谷氨酸積累型菌體的轉(zhuǎn)變)一般為4 h，而超聲發(fā)酵開始能夠檢測(cè)到谷氨酸的時(shí)間為2 h，并且產(chǎn)酸速率迅速上升。同時(shí)結(jié)合鏡檢發(fā)現(xiàn)，2 h時(shí)超聲發(fā)酵的部分谷氨酸菌體已經(jīng)拉長(zhǎng)、膨大成為了產(chǎn)酸型菌體。因此，超聲發(fā)酵開始產(chǎn)酸的時(shí)間提前了2 h(如圖6所示)。

圖6 最佳超聲條件下發(fā)酵對(duì)菌體轉(zhuǎn)型時(shí)間和副產(chǎn)物的影響

Fig.6 Effect of optimal ultrasound conditions on bacterial transformation time and byproducts

超聲結(jié)束時(shí)間之所以選在發(fā)酵8 h，一方面是因?yàn)楣劝彼岚魻顥U菌的細(xì)胞壁較厚，對(duì)細(xì)胞膜有一定的保護(hù)作用，超聲時(shí)間太短，并不能起到損傷細(xì)胞膜以提高通透性的作用；另一方面，菌體自身有一定的細(xì)胞膜修復(fù)功能，因此要有足夠的超聲時(shí)長(zhǎng)。8 h鏡檢發(fā)現(xiàn)，幾乎所有菌體已完成谷氨酸分泌的轉(zhuǎn)型，不需要對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行更多的損傷，同時(shí)OD值也即將達(dá)到最大值，菌體的活力即將達(dá)到最高，如果繼續(xù)進(jìn)行超聲處理，勢(shì)必會(huì)對(duì)菌體造成嚴(yán)重?fù)p害，進(jìn)而菌體活力也會(huì)下降，因此選擇8 h停止超聲處理?？偟膩?lái)看，超聲發(fā)酵的OD值為82.5，較對(duì)照發(fā)酵的72.5，提高了13.8%；谷氨酸產(chǎn)量為168 g/L，較對(duì)照發(fā)酵的151 g/L，提高了11.3%；糖酸轉(zhuǎn)化率為68.2%，較對(duì)照發(fā)酵的65.4%，提高了4.3%。

另一方面，由于菌體活力、谷氨酸產(chǎn)量的提高，溶解氧量的提高[20]，可知TCA循環(huán)的速率和通量也得到了提升，而由糖酵解所得的丙酮酸也會(huì)更多的進(jìn)入三羧酸循環(huán)而不會(huì)過(guò)多積累[21-22]，因此由丙酮酸所產(chǎn)生的副產(chǎn)物乳酸和丙氨酸也分別由對(duì)照發(fā)酵的3.6、2.54 g/L降低至超聲發(fā)酵的2.3、1.75 g/L，如圖6所示。

3 結(jié)論

超聲輔助細(xì)胞轉(zhuǎn)型的谷氨酸發(fā)酵工藝，不但能夠加快菌體生長(zhǎng)速率，提高菌體活力，提前完成菌體轉(zhuǎn)型，而且能進(jìn)一步提高菌體細(xì)胞膜通透性，谷氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率。本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了超聲輔助谷氨酸發(fā)酵的最佳條件為超聲時(shí)間50 s、振幅65%、間隔時(shí)間5 min，發(fā)酵開始進(jìn)行超聲處理，至8 h結(jié)束。最終OD值提高13.8%，谷氨酸產(chǎn)量提高11.3%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高4.3%。因此，可以說(shuō)超聲波技術(shù)在谷氨酸發(fā)酵中的作用是明顯且有效的，它能夠進(jìn)一步提高菌體細(xì)胞膜的通透性，加快谷氨酸分泌，實(shí)現(xiàn)了高效率發(fā)酵。