劉保光，蔡 田，李小申，劉營營，賀丹丹，匡秀華，高延玲，胡功政,

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院制藥工程學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.河南省獸藥監(jiān)察所，河南 鄭州 450008）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種常見的人獸共患病原菌，是導(dǎo)致食物中毒重要的食源性病原菌，也是造成人和動物感染的主要病原菌之一[1-2]。金黃色葡萄球菌在自然界分布較廣泛，如空氣、土壤、食品等均可存在。據(jù)國外有關(guān)報道[3-5]，金黃色葡萄球菌在奶及乳制品等食品中大量存在并廣泛流行，生鮮牛奶是金黃色葡萄球菌感染的潛在載體。在中國，金黃色葡萄球菌是引起牛、羊乳房炎的重要病原菌之一，且在牛乳及羊乳中廣泛存在[6]。此外，金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生大量的毒力因子，主要包括腸毒素、剝脫毒素、中毒休克毒素-1和殺白細胞毒素等，這些毒力因子在金黃色葡萄球菌感染中扮演著重要角色[7]。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶腸毒素的金黃色葡萄球菌引起的食物中毒發(fā)生、發(fā)展比較迅速，對人類的身體健康危害較大，金黃色葡萄球菌攜帶的腸毒素是導(dǎo)致食源性中毒的主要毒力因子[8]。

目前，金黃色葡萄球菌常用的分型方法主要有多位點序列分型、金黃色葡萄球菌蛋白A、脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）和葡萄球菌盒式染色體mec分型等[9]。其中，PFGE分型被公認為是細菌分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，主要原理是利用金黃色葡萄球菌基因組DNA進行原位酶切，分析菌株間遺傳相關(guān)性[10]。開展金黃色葡萄球菌PFGE分型，對了解菌株的流行病學(xué)分子特征、控制克隆株的傳播具有重要的意義。近年來，國內(nèi)外對金黃色葡萄球菌分離鑒定、耐藥性及分子分型報道較為多見[11-13]，對患有奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌耐藥性、毒素基因檢測方面也有報道[14]，但是，從健康奶牛采集的生鮮牛奶金黃色葡萄球菌莢膜多糖血清型鑒定、耐藥性及PFGE分型報道鮮見[15]。

鑒于此，本實驗對河南省不同地區(qū)健康動物牛奶源金黃色葡萄球菌進行莢膜多糖血清型鑒定、毒力基因檢測及PFGE分型研究，旨在闡述該菌攜帶毒力基因情況及克隆傳播的分子特征，為生鮮牛奶的安全評價提供理論依據(jù)，為下一步研究耐藥機制提供參考，這對加強我國乳及乳品血清型、毒力基因檢測及分子分型研究具有重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

80 株金黃色葡萄球菌于2014—2015年間采集于河南省不同地區(qū)（編號A1～A4）健康動物奶牛養(yǎng)殖場生鮮牛奶樣品，沙門菌H9812由河南省獸藥監(jiān)察所惠贈。

1.1.2 培養(yǎng)基

TSA、BHI及LB培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基 法國科瑪嘉公司。

1.1.3 試劑

內(nèi)切酶XbaI、SmaI 大連寶生物公司；2×Taq Master Mix、DNA Marker 北京康為世紀有限公司；Agarose L.M.P、蛋白酶K 北京索萊寶有限公司；SeaKem?Gold Agarose金膠瓊脂糖 美國Lonza公司。

1.1.4 引物

實驗研究所用基因引物，均由上海生物工程有限責(zé)任公司合成、測序。

1.2 儀器與設(shè)備

高速臺式離心機 德國Thermo公司；CHEE MAPPER型PFGE 美國伯樂公司；Gene Genius凝膠成像系統(tǒng) 英國Syngene公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 杭州晶格科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌的分離鑒定

將采集的牛奶樣經(jīng)離心取混勻沉淀物分別接種于BHI瓊脂、TSA瓊脂及科瑪嘉顯色培養(yǎng)基[16]，經(jīng)37 ℃過夜培養(yǎng)，挑單菌落接種于BHI肉湯，涂片染色鏡檢，并通過VITEK-2系統(tǒng)鑒定。對鑒定后的菌株進行基因組DNA提?。舆m量溶菌酶），作為PCR模板。為確證所分離菌株，參考相關(guān)報道[17]，利用特異性引物（F：5’-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3’；R：5’-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3’）進行PCR擴增nuc基因及電泳檢測，測序后在NCBI用BLAST比對。金黃色葡萄球菌ATCC 29213為陽性對照菌株。

1.3.2 莢膜多糖血清型鑒定

金黃色葡萄球菌的莢膜多糖是其致病和免疫的基礎(chǔ)，據(jù)有關(guān)研究表明[18]，大概80%金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生cap5型或cap8型莢膜多糖，本實驗利用（cap5 F：5’-GAAAGTGAACGATTAGTAGAA-3’，cap5 R：5’-GTACGAAGCGTTTTGATAGTT-3’；cap8 F：5’-GTGGGATTTTTGTAGCTTTT-3’，cap8 R：5’-CGCCTCGCTATATGAACTAT-3’）引物對cap基因可變區(qū)PCR擴增。

1.3.3 毒力基因測定

對24 種毒力基因（腸毒素、溶血素、殺白細胞毒素、凝集因子、中毒休克毒素和表皮剝脫毒素6 大類）進行PCR擴增[19-23]。PCR體系為20 μL，其中2×Taq Master Mix Premix Taq酶10 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，去離子水6 μL。PCR參數(shù)為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30 次，72 ℃延伸8 min。PCR擴增后分別取8 μL產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳。若陽性，進行測序，在NCBI進行BLAST比對。

1.3.4 PFGE分型

1.3.4.1 細菌培養(yǎng)與小膠塊制備

金黃色葡萄球菌PFGE的操作參照美國疾病預(yù)防控制中心提供的方法[24]，挑取LB板上的單菌落接種于4 mL LB肉湯中，37 ℃過夜培養(yǎng)；收集菌液，10 000 r/min離心2 min，沉淀用200 μL TE緩沖液混勻，調(diào)整細菌濁度為1.8～2.4；向200 μL菌懸液加入6 μL溶葡萄球菌素酶（1 mg/mL），37 ℃作用4 h；再加入等體積的60 ℃預(yù)熱已融化的2%低熔點小膠，輕輕混勻后迅速倒入模具，4 ℃冷卻30 min，備用。

1.3.4.2 細菌裂解與酶切

將制備好的小膠塊放于2 mL EC細胞裂解液中裂解5 h以上，用TE緩沖液洗滌3～5 次，每次30 min，該過程在搖床緩慢搖，取約2 mm寬的膠條，用TE緩沖液平衡后，加入SmaI內(nèi)切酶4 μL于37 ℃酶切6 h。沙門菌H9812用XbaI內(nèi)切酶37 ℃酶切3 h。

1.3.4.3 加樣、電泳及圖像分析

配制1% SeaKem Gold瓊脂糖凝膠，把酶切好的膠條小心放入梳孔中，在空隙中加入融化的瓊脂糖凝膠封口，最后用1% SeaKem Gold瓊脂糖完全浸沒膠條，凝固后將整塊膠放入CHEF Mapper電泳儀的緩沖液中電泳。電泳條件：6 V/cm，脈沖時間5～42 s，14 ℃，角度120°，時間19 h。結(jié)束后將膠塊放入溴化乙錠中染色30 min，蒸餾水清洗10 min，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖片，并保存為TIFF格式。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用BioNumerics軟件的UPGMA和Dice參數(shù)對圖片進行數(shù)據(jù)分析，得出聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離鑒定

350 份生鮮牛奶樣品經(jīng)分離培養(yǎng)、顯色培養(yǎng)基篩選、nuc基因PCR檢測，共得到80 株金黃色葡萄球菌，檢出率為22.86%（表1）。河南4 個地區(qū)中，來自A1地區(qū)的樣品分離率最高，為34.9%（30/86）；來自A4地區(qū)的樣品分離率最低，為12.5%（11/88）。

表1 生鮮牛奶樣品中金黃色葡萄球菌的流行Table1 Prevalence of S. aureus isolates from fresh milk

2.2 莢膜多糖血清型鑒定

莢膜多糖血清型鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，80 株金黃色葡萄球菌有70株可以通過莢膜多糖分型。48 株屬于cap5血清型（60%，48/80），22 株屬于cap8血清型（27.5%，22/80），本實驗可見，cap5血清型是流行血清型。

2.3 毒力基因測定結(jié)果

如表2所示，本實驗中24 種毒力基因，有21 種被檢測到，但表皮剝脫毒素基因（eta、etb和etd）未檢測到。從80 株金黃色葡萄球菌中共檢測到62 株（77.5%）攜帶有毒力基因，檢測率較高。本實驗檢出率較高的毒力基因有set、hlb、hld、lukED、cna、ebp、clfA和clfB，檢出率分別為40.00%（32/80）、51.25%（41/80）、57.50%（46/80）、60.00%（48/80）、47.50%（38/80）、58.75%（47/80）、57.50%（46/80）和58.75%（47/80）。中毒休克毒素（tsst）和殺白細胞毒素（pvl）檢出率較低，分別為1.25%（1/80）和2.50%（2/80）。

80 株金黃色葡萄球菌中，攜帶的毒力基因譜型較為多樣化，既有含單個基因的，又有含多個基因的。但是，有47株（58.75%）菌攜帶不少于6種毒力基因，最常見的毒力基因譜型為set-hla-hlb-hld-lukED-cna-ebp-clfA-clfB（表2）。

表2 金黃色葡萄球菌毒力基因檢測結(jié)果（n=80）Table2 PCR detection of virulence genes from S. aureus isolates (n= 80)

2.4 PFGE分型

PFGE結(jié)果顯示，成功獲得72 株菌清晰的PFGE圖譜（72 株能被SmaI酶切開）。使用BioNumerics分析軟件進行聚類，如圖1所示，以90%的相似性可將其分為12 個簇（A～L）和46 種PFGE型。其中A簇分為3 種PFGE型（3 株，PFGE1～PFGE3）；B簇分為3 種PFGE型（5 株，PFGE5～PFGE7）；C簇分為2 種PFGE型（2 株，PFGE9、PFGE10）；D簇分為3 種PFGE型（11 株，PFGE11～PFGE13）；E簇僅含有1 種PFGE型（2 株，PFGE14）；F簇僅含有1 種PFGE型（2 株，PFGE17）；G簇分為3 種PFGE型（7 株，PFGE18～PFGE20）；H簇僅含有1 種PFGE型（3 株，PFGE22）；I簇分為5 種PFGE型（7 株，PFGE25～PFGE29）；J簇分為5 種PFGE型（9 株，PFGE30～PFGE34）；K簇分為4 種PFGE型（6 株，PFGE35～PFGE38）；L簇分為3 種PFGE型（3 株，PFGE42～PFGE44）。

PFGE聚類表明，同一地區(qū)牛奶源金黃色葡萄球菌主要以克隆方式進行傳播，但相同地區(qū)菌株呈現(xiàn)的PFGE型別具有多樣性的差異。盡管不同地區(qū)分離得到的菌株中有個別為相同的克隆型（如B簇、E簇），但是不同地區(qū)牛奶中流行的金黃色葡萄球菌的克隆型具有較大的差異。此外，D簇、G簇和J簇的菌株均檢出一定基因類型的毒力基因，表明河南地區(qū)生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌毒力基因廣泛存在于多種PFGE型別中。

圖1 金黃色葡萄球菌PFGE圖譜聚類分析（n=72）Fig.1 Cluster analysis of PFGE types from S. aureus isolates (n = 72)

3 討 論

金黃色葡萄球菌是重要的人獸共患病原菌，要求在各類食品不被檢出。但本研究結(jié)果顯示，生鮮牛奶中存在一定程度的金黃色葡萄球菌污染，檢出率為22.86%，高于劉冬香等[25]報道的檢出率為10.54%，但低于張倩等[26]報道的檢出率47.24%。進一步推測可能是與采集的樣品地點、樣品的數(shù)量及采集的年代等有關(guān)。此外，本實驗利用PCR對金黃色葡萄球菌的nuc基因進行擴增，其檢測結(jié)果與通過微生物培養(yǎng)鑒定的結(jié)果100%符合。近年來，各級政府監(jiān)管機構(gòu)對食品安全愈發(fā)重視，要求從源頭杜絕金黃色葡萄球菌對食品的污染，以降低金黃色葡萄球菌在各類食品中的檢出率。

據(jù)劉秀麗等[27]報道，金黃色葡萄球菌莢膜多糖被分為11 個血清型，其中cap5型和cap8型為流行血清型，約占臨床菌株的70%～80%。Goerke等[18]研究發(fā)現(xiàn)，cap8為流行血清型。本實驗結(jié)果顯示，48 株屬于cap5血清型（60%，48/80），22 株屬于cap8血清型（27.5%，22/80），cap5為流行血清型。

共檢測到62 株（77.5%）攜帶有毒力基因，且攜帶的毒力基因譜型多樣。本實驗測定牛奶源中金黃色葡萄球菌的腸毒素基因種類（sea～set）表明，腸毒素基因檢出率為90.00%（72/80），檢出率最高的為set（40.00%），其次為seb（17.50%）。據(jù)趙俊利等[14]報道金黃色葡萄球菌腸毒素基因（sea～seo）檢測率為96.2%，攜帶率最高的為sej（62.26%），其次為sen（49.06%）。據(jù)張靜等[28]測定原料乳中金黃色葡萄球菌腸毒素基因（sea～sej）研究表明，腸毒素基因檢出率為70.45%，檢出率最高的為sea（56.82%）。推測這可能與菌株來源、地域性質(zhì)等有一定關(guān)系，也進一步說明不同地區(qū)生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌腸毒素基因的流行不同。據(jù)章樂怡等[29]報道傳統(tǒng)腸毒素基因（sea～see）占金黃色葡萄球菌引起食物中毒的95%。本研究也檢測到傳統(tǒng)腸毒素基因（sea～see），進一步說明河南省生鮮牛奶中存在一定的安全隱患，應(yīng)予以重視。

但是，本研究中，殺白細胞毒素（pvl）的檢出率較低，僅為2.50%（2/80），與謝秀蘭等[30]報道的檢出率34.4%存在較大差異，這說明不同地區(qū)pvl的檢出率不盡相同，進一步暗示了牛奶等食品中pvl基因的流行可能存在一定的地域差異。攜帶毒力基因hlb、hld、lukED、ebp、clfA和clfB的菌株均達50%以上，有47 株（58.75%）菌攜帶多種毒力基因，毒力基因譜型set-hla-hlb-hld-lukED-cna-ebp-clfA-clfB最為常見。這與楊峰等[31]報道含lukED、hlb和hld基因的菌株均達70%以上相吻合。雖毒力基因并不能作為菌株致病的標(biāo)準(zhǔn)，而其潛在的風(fēng)險應(yīng)當(dāng)予以關(guān)注。但攜帶高頻的hlb、hld、lukED、ebp、clfA和clfB毒力基因，暗示其在致病性方面具有重要作用。

本研究對牛奶源金黃色葡萄球菌PFGE型別進行分析，建立河南地區(qū)牛奶源金黃色葡萄球菌PFGE分型數(shù)據(jù)庫，包含12 個簇和46 種PFGE型。PFGE聚類表明，同一地區(qū)的菌株主要以克隆傳播進行擴散，且相同地區(qū)的菌株呈現(xiàn)的PFGE型別具有多樣性。而不同地區(qū)菌株又可劃分在同一PFGE型別中，如B簇和E簇，表明該型菌株在河南地區(qū)不同奶牛場具有一定流行性，這與王桂琴等[32]的報道認為一些菌株呈現(xiàn)相同的PFGE型別能在不同奶牛場流行觀點相一致，推測可能存在一定的傳播。另外，D簇、G簇和J簇均檢出一定基因類型的毒力基因，表明河南地區(qū)生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌毒力基因廣泛存在于多種PFGE型別中，揭示這幾種PFGE型別的流行可能與毒力基因的存在有一定的相關(guān)性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)8株不能被SmaI酶切的菌株，據(jù)有關(guān)研究報道[33]，這種類型菌株可在動物與人之間傳播，具有較大的危害性。