凌 晨，謝 兵，洪羽婕，王 莉，金 鵬*，鄭永華

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

桃果實(shí)果肉柔軟細(xì)膩、鮮美多汁，深受廣大消費(fèi)者喜愛。由于桃果實(shí)采摘時(shí)正值高溫多雨的夏季，且桃屬于典型的呼吸躍變型果實(shí)，采后在常溫下迅速后熟軟化，容易受機(jī)械損傷從而被病原菌侵染，極易腐爛變質(zhì)[1]。同時(shí)，桃又是一種對低溫非常敏感的水果，低于10 ℃貯藏2～3 周后極容易出現(xiàn)冷害癥狀，導(dǎo)致果肉褐變、絮狀敗壞或木質(zhì)化、風(fēng)味喪失、果汁減少等現(xiàn)象，極大地降低了商品價(jià)值[2]。低溫冷害是影響桃果實(shí)采后貯藏保鮮、運(yùn)輸和制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙因子。因此，研究桃果實(shí)冷害的發(fā)生機(jī)制以及如何有效提高桃果實(shí)抗冷性從而延長貯藏期和貨架期，一直是采后貯藏和運(yùn)輸產(chǎn)業(yè)亟需解決的問題。

Ca2＋是生物必需營養(yǎng)元素之一，其在植物體內(nèi)也發(fā)揮著十分重要的作用。Ca2＋是細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的必需物質(zhì)，在維護(hù)其正常結(jié)構(gòu)與功能、減少或延緩膜的損傷等方面具有重要作用[3]。然而，Ca2＋不僅只發(fā)揮基礎(chǔ)營養(yǎng)元素的作用，它還是耦聯(lián)胞外信號與胞內(nèi)生理反應(yīng)的第二信使，參與植物因外界刺激而引起的自身反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)植物細(xì)胞對逆境信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]。近年來諸多研究表明，添加外源鈣（Ca2＋）對提高果實(shí)抵御低溫脅迫具有積極作用。王大偉等[5]研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% CaCl2能較好地保持冬棗的品質(zhì)，有效抑制低溫貯藏期間冬棗腐爛的發(fā)生。劉萍等[6]對金柑果實(shí)進(jìn)行次氯酸鈣浸泡，發(fā)現(xiàn)其能有效降低果實(shí)腐爛率，提高抗氧化酶類（過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD））的活力并延緩其降低速率。Kou Xiaohong等[7-8]發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% CaCl2溶液浸泡處理能有效抑制‘黃冠’梨褐斑病的發(fā)生，提高梨果實(shí)過氧化氫酶（catalase，CAT）、SOD活力，同時(shí)能保持梨果實(shí)中的蘋果酸含量，較好地維持果實(shí)的口感和品質(zhì)。梁慶沙等[9]研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% CaCl2和0.1% VC混合液處理桃果實(shí)，能較長時(shí)間維持果實(shí)硬度，減少可溶性果膠和松弛結(jié)核性多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，有助于延長果實(shí)貨架期。隨著植物鈣調(diào)素（CaM）的發(fā)現(xiàn)與深入研究，Ca2＋的第二信使功能使Ca2＋成為植物代謝的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)[10]。Ca2＋參與植物細(xì)胞對低溫脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)表現(xiàn)為：當(dāng)植物受到不適宜的低溫脅迫時(shí)，Ca2＋會與其受體蛋白CaM結(jié)合，激活一系列靶酶和非酶蛋白，通過形成鈣-鈣調(diào)素（Ca2＋-CaM）復(fù)合體來誘導(dǎo)和調(diào)控植物的保護(hù)酶系統(tǒng)，引起一系列的自我保護(hù)反應(yīng)，從而調(diào)控相關(guān)生理代謝及基因表達(dá)[10-11]。三氟拉嗪（trifluoperazin，TFP）是一種鈣調(diào)素拮抗劑，能影響Ca2＋-CaM復(fù)合體的功能，引起植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的障礙。利用Ca2＋和TFP處理實(shí)驗(yàn)材料，通過增強(qiáng)和阻礙Ca2＋-CaM復(fù)合體的形成這兩個(gè)方面進(jìn)行考察，是目前研究植物鈣-鈣調(diào)素（Ca2＋-CaM）信使系統(tǒng)的重要手段。國內(nèi)外已有研究表明，當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫以及植物激素刺激時(shí)，均會導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2＋濃度的變化，Ca2＋參與了植物和果實(shí)在不同環(huán)境下抗冷能力的變化，與植物的抗冷性有著密切聯(lián)系[12-13]。

目前，對Ca2＋-CaM復(fù)合體的抗逆性研究已經(jīng)在茄子幼苗[14]、辣椒幼苗[15]和黃瓜[16]等原材料上進(jìn)行，但在桃果實(shí)上還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用外源鈣和鈣調(diào)素拮抗劑（TFP）浸泡處理桃果實(shí)，通過對采后冷藏桃果實(shí)冷害和活性氧代謝等方面的研究，以期從增強(qiáng)和阻礙Ca2＋-CaM復(fù)合體的形成兩個(gè)方面探討Ca2＋-CaM復(fù)合體在調(diào)控桃果實(shí)抗冷性方面的作用機(jī)理，為添加外源鈣在桃果實(shí)采后低溫貯藏和運(yùn)輸中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以八成熟‘白鳳’水蜜桃果實(shí)（Prunus persica Batsch ‘Baifeng’）為材料，于2017年7月采收于江蘇省農(nóng)科院果園，采摘后2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，散去田間熱，挑選色澤、大小基本一致，無病蟲害和機(jī)械損傷的果實(shí)。

愈創(chuàng)木酚、對氨基苯磺酸、四氯化鈦、VC、鄰菲啰啉、2-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric，TBA）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、磺基水楊酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；核黃素、甲硫氨酸、氮藍(lán)四唑（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、無水CaCl2、α-萘胺、鹽酸羥胺、Folin試劑、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、酸性茚三酮、脯氨酸、L-鳥氨酸、α-酮戊二酸、磷酸吡哆醛、還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH） 南京杰汶達(dá)試劑器材有限公司；TFP 北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MIR-253三洋恒溫培養(yǎng)箱 上海恒逸實(shí)業(yè)有限公司；HZ602A型電子天平 慈溪紅鉆衡器設(shè)備有限公司；PAL-1手持阿貝折光儀 日本Atago公司；GY-3型水果硬度計(jì) 衢州艾普計(jì)量儀器有限公司；QL-861型振蕩儀海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；GL-20G-H型冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；FA1204B型分析天平賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；UV-1600型紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；DDS-11A型電導(dǎo)率儀 上海第二分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將挑選出的桃果實(shí)隨機(jī)分成3 組，將其中兩組桃果實(shí)分別在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% CaCl2和200 μmol/L TFP溶液中浸泡10 min，剩下一組在蒸餾水中浸泡10 min（對照組）。浸泡后使其自然晾干，然后將每6 個(gè)桃果實(shí)裝入一個(gè)0.01 mm厚聚氯乙烯塑料袋，袋口用普通橡皮筋繞兩圈，隨后放入（5±1）℃、相對濕度90%的恒溫箱中貯藏5 周。貯藏期間每隔1 周進(jìn)行取樣并分析測定相關(guān)品質(zhì)和生理指標(biāo)。另外，每周取部分桃果實(shí)放在20 ℃條件下模擬3 d貨架期，使桃果實(shí)冷害癥狀充分顯現(xiàn)，并測定桃果實(shí)硬度、出汁率和可溶性固形物（total soluble solid，TSS）質(zhì)量分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)中其余指標(biāo)均為貯藏期間取樣測定。

1.3.2 果肉硬度的測定

在桃果實(shí)赤道部位（橫徑最大處）挑選對稱的兩點(diǎn)去皮（厚度1 mm），用硬度計(jì)測定桃果實(shí)硬度，每次測定8 個(gè)桃果實(shí)，結(jié)果取平均值。

1.3.3 果肉出汁率的測定

參照Ling Chen等[17]的方法測定，用直徑6 mm的打孔器在每個(gè)去皮后的桃果實(shí)上取出肉柱，分別切下厚度均勻的片狀果實(shí)，每次取8 片來自不同桃果實(shí)的肉片放入已稱質(zhì)量的裝有吸水紙的離心管（m1/g）中，并稱此時(shí)的質(zhì)量（m2/g），1 500×g離心10 min后取出果肉再稱質(zhì)量（m3/g），重復(fù)3 次。出汁率計(jì)算見公式（1）。

1.3.4 TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

將桃果實(shí)樣品在研缽中研磨成勻漿，再用手持折光儀測定桃果實(shí)TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)，重復(fù)3 次。

1.3.5 褐變指數(shù)的測定

取10 個(gè)桃果實(shí)，將果實(shí)縱向切開，按照桃果實(shí)果心褐變面積占果實(shí)切面總面積的百分比將褐變程度分為5 個(gè)等級。0級：沒有褐變；1級：褐變面積小于5%；2級：褐變面積在5%～25%之間；3級：褐變面積在25%～50%之間；4級：褐變面積大于50%。褐變指數(shù)的計(jì)算見公式（2）。

1.3.6 相對電導(dǎo)率的測定

按照測果肉出汁率的方法取出8 片果肉圓片放入25 m L具塞刻度試管，同時(shí)加入2 0 m L去離子水，搖勻后放置3 0 m i n，用電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率（P1/（μ S/c m）），然后將試管煮沸15 min，待冷卻到室溫后再次測定電導(dǎo)率（P2/（μS/cm）），重復(fù)3 次。相對電導(dǎo)率計(jì)算見公式（3）。

1.3.7 丙二醛含量的測定

取2 g桃果肉樣品放入研缽，加入5 mL 50 g/L TCA溶液，冰浴條件下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，4 ℃、12 000×g條件下離心20 min，所得上清液即為待測溶液。取2 mL待測溶液于試管中，加入2 mL 6.7 g/L TBA溶液，混勻后在沸水浴下反應(yīng)30 min，待煮沸后的混合液冷卻置室溫，紫外-可見分光光度計(jì)分別測定混合液在450、532 nm和600 nm波長處的吸光度，分別記為A1、A2、A3。為消除果肉中可溶性糖類物質(zhì)引起的誤差，反應(yīng)混合液中丙二醛（malondialdehyde，MDA）濃度（c）計(jì)算見公式（4），MDA含量計(jì)算見公式（5）。

式中：V0表示樣品提取液總體積/mL；V1表示測定時(shí)所取樣品提取液體積/mL；m0表示樣品質(zhì)量/g。1.3.8 VC含量的測定

VC含量的測定參考梁敏華等[18]的方法并稍作修改。待測溶液的提取方法同1.3.7節(jié)。提前分別將1 mL 50 g/L TCA溶液、1 mL無水乙醇、0.5 mL體積分?jǐn)?shù)0.4%磷酸溶液、1 mL5 g/L鄰菲啰啉溶液加入試管，然后加入1 mL待測溶液和0.5 mL 0.3 g/L FeCl3溶液，振蕩搖勻后放置在30 ℃水浴中反應(yīng)1 h，測定混合液在534 nm波長處的吸光度。單位為mg/kg，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。1.3.9 SOD、CAT、APX活力的測定

SOD活力參照J(rèn)in Peng等[19]的方法，用NBT光還原法進(jìn)行測定，分別向試管中加入0.1 mL待測酶液和1.8 mL磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.8），然后分別加入體積均為0.3 mL的130 mmol/L蛋氨酸溶液、0.75 mmol/L NBT溶液和0.1 mmol/L EDTA-2Na溶液，最后加入0.3 mL 20 μmol/L核黃素溶液，置于4 000 lx日光燈下反應(yīng)15 min后，立即取出置于暗處終止反應(yīng)。以不經(jīng)日光燈照射作空白對照，測定混合液在560 nm波長處的吸光度；以每克鮮樣品每分鐘在560 nm波長處對NBT光化還原的抑制為50%時(shí)為1 個(gè)SOD活力單位。

CAT活力參照Zhang Yu等[20]的方法進(jìn)行測定并稍作修改，反應(yīng)體系包括2.5 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）、0.3 mL待測酶液以及0.2 mL、體積分?jǐn)?shù)0.75% H2O2溶液，振蕩搖勻后立即測定混合液2 min內(nèi)在240 nm波長處吸光度的變化；以每克鮮樣品每分鐘在240 nm波長處吸光度變化0.01為1 個(gè)酶活力單位。

APX活力參照孫玉潔等[21]的方法進(jìn)行測定并稍作修改，向試管中加入2.2 mL 50 mmol/L pH 7.5磷酸鹽緩沖液（含0.1 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L VC）和0.5 mL待測酶液，最后加入0.3 mL2 mmol/L H2O2溶液啟動反應(yīng)，振蕩搖勻后立即測定混合液5 min內(nèi)在290 nm波長處吸光度的變化。以每克鮮樣品每分鐘在290 nm波長處吸光度變化0.01為1 個(gè)酶活力單位。

例2 北京同仁堂是中藥行業(yè)著名的老字號，創(chuàng)建于清康熙八年(1669)，自雍正元年(1723)正式供奉清皇宮御藥房用藥，歷經(jīng)八代皇帝，長達(dá)188年。

以上酶活力單位均為U/g，且均以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.11 脯氨酸含量和P5CS、PDH、OAT活力的測定

脯氨酸含量參照Shan Timin等[24]的方法進(jìn)行測定并稍作修改，取2 g桃果肉樣品放入研缽，加入5 mL 30 g/L磺基水楊酸，冰浴條件下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，4 ℃、12 000×g條件下離心20 min，所得上清液即為待測溶液。向準(zhǔn)備好的25 mL試管中加入2 mL冰醋酸及3 mL酸性茚三酮試劑，最后加入2 mL待測溶液，沸水浴30 min后溶液呈紅色。取出試管，待冷卻后加入4 mL甲苯，搖蕩靜置。待溶液分層后吸取上層于比色皿中測定其在520 nm波長處的吸光度，單位為μg/g。

Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS）、脯氨酸脫氫酶（proline dehydrogenase，PDH）和鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ornithine δ-aminotransferase peroxidase，OAT）活力參照Shang Haitao等[25]的方法進(jìn)行測定。P5CS反應(yīng)體系包括1.3 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.2）、0.3 mL待測酶液以及0.2 mL 1.5 mmol/L NADPH溶液；以每克鮮樣品每分鐘在340 nm波長處吸光度變化0.001為1 個(gè)酶活力單位。PDH反應(yīng)體系包括1.3 mL 0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH 10.3）、0.3 mL 0.1 mol/L脯氨酸溶液、0.4 mL待測酶液以及0.15 mL10 mmol/L NADPH溶液。以每克鮮樣品每分鐘在340 nm波長處吸光度變化0.001為1 個(gè)酶活力單位。OAT反應(yīng)體系包括0.1 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.0，含35 mmol/L L-鳥氨酸、5 mmol/L α-酮戊二酸和0.05 mmol/L磷酸吡哆醛）和0.3 mL待測酶液；以每克鮮樣品每分鐘在510 nm處吸光度變化0.001為1 個(gè)酶活力單位。以上酶活力單位均為U/g。

1.3.12 GSH含量和GR活力的測定

谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量參照韓一林等[26]的方法進(jìn)行測定并稍作修改，取2 g桃果肉樣品放入研缽，加入5 mL 50 g/L TCA溶液，冰浴條件下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，4 ℃、12 000×g條件下離心20 min，所得上清液即為待測溶液。取兩支試管，分別加入1 mL待測溶液和1 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.7），然后向其中一支試管加入0.5 mL1 mmol/L二硫代硝基苯甲酸（5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）溶液，另一支試管中加入0.5 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.8），置于25 ℃保溫10 min，迅速測定其在412 nm波長處的吸光度，單位為μmol/g。

GR活力參照曲丹陽等[27]的方法進(jìn)行測定，反應(yīng)體系包括2.7 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）、0.1 mL5 mmol/L GSSG溶液、0.2 mL待測酶液和40 μL1 mmol/L NADPH溶液。以每克鮮樣品每分鐘在340 nm波長處吸光度變化0.01為1 個(gè)酶活力單位，單位為U/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣和鈣調(diào)素拮抗劑處理對桃果實(shí)貨架期品質(zhì)的影響

貯藏不同時(shí)間并進(jìn)行貨架3 d后，桃果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)見表1。貯藏時(shí)間越長，模擬貨架3 d后硬度越低，表明桃果實(shí)發(fā)生了后熟軟化。貯藏不同時(shí)間并進(jìn)行貨架3 d后，CaCl2處理組均表現(xiàn)為硬度最高；貯藏35 d＋貨架3 d各處理組中，CaCl2處理組硬度顯著高于TFP處理組（P＜0.05），是其1.76 倍。在貯藏不同時(shí)間并進(jìn)行貨架3 d時(shí)，桃果實(shí)出汁率隨貯藏時(shí)間延長呈現(xiàn)上升趨勢，CaCl2處理組出汁率最低，其次為對照組，TFP處理組出汁率最高，CaCl2處理組出汁率顯著低于TFP處理組（P＜0.05），表明CaCl2處理能較好地延緩桃果實(shí)軟化。貯藏時(shí)間越長，貨架3 d后桃果實(shí)TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低，CaCl2處理組TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，其次為對照組，TFP處理組TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，CaCl2處理組TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于TFP處理組（P＜0.05）。

表1 鈣和鈣調(diào)素拮抗劑處理對冷藏桃果實(shí)貨架期品質(zhì)指標(biāo)的影響Table1 Effects of calcium and trif l uoperazin treatments on quality parameters of peach fruit during shelf life after cold storage

2.2 鈣和鈣調(diào)素拮抗劑處理對桃果實(shí)貯藏期間果心褐變的影響

圖1 鈣和鈣調(diào)素拮抗劑處理對桃果實(shí)冷藏過程中褐變指數(shù)的影響Fig.1 Effects of calcium and trif l uoperazin treatments on internal browning index in cold-stored peach fruits

隨著貯藏時(shí)間延長，各處理組桃果實(shí)果心褐變指數(shù)不斷增加。如圖1所示，貯藏至21 d，各處理組均開始發(fā)生明顯冷害，出現(xiàn)果心褐變癥狀，隨后不斷上升。CaCl2處理組在整個(gè)貯藏期間桃果實(shí)褐變指數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05），而TFP處理組褐變指數(shù)顯著高于對照組和CaCl2處理組（P＜0.05）。在貯藏結(jié)束時(shí)，經(jīng)CaCl2處理的果實(shí)果心褐變指數(shù)僅為對照組的77.6%，而TFP處理加劇了褐變程度，是對照組的1.17 倍。這表明CaCl2處理明顯抑制了果心褐變，提高桃果實(shí)抗冷性；而TFP處理加劇了桃果實(shí)采后冷害，縮短果實(shí)貯藏壽命和貨架期。不同處理組在貯藏28 d、貨架3 d后的果實(shí)見圖2。

圖2 貨架結(jié)束后不同處理組桃果實(shí)照片F(xiàn)ig.2 Photographs of peach fruit subjected to different treatments at the end of shelf-life

2.3 鈣和鈣調(diào)素拮抗劑處理對桃果實(shí)貯藏期間相對電導(dǎo)率和MDA含量的影響

圖3 鈣和鈣調(diào)素拮抗劑處理對桃果實(shí)冷藏過程中相對電導(dǎo)率（A）和MDA含量（B）的影響Fig.3 Effects of calcium and trif l uoperazin treatments on relative electric conductivity （A） and MDA content （B） in cold-stored peach fruit

如圖3A、B所示，桃果實(shí)在冷藏期間相對電導(dǎo)率和MDA含量總體呈逐漸上升的趨勢。CaCl2處理組的相對電導(dǎo)率低于對照組和TFP處理組，CaCl2處理在一定程度上保持了桃果實(shí)細(xì)胞膜良好的完整性，而TFP處理則加劇了相對電導(dǎo)率的上升，但兩個(gè)處理組之間差異不顯著（圖3A）。MDA是細(xì)胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，在桃果實(shí)采后冷害過程中，其含量總體呈現(xiàn)上升趨勢（圖3B）。在冷藏的第35天，CaCl2處理組MDA含量低于對照組和TFP處理組，而TFP處理組高于對照組。表明CaCl2處理通過促進(jìn)Ca2＋-CaM復(fù)合體的形成，減緩低溫脅迫對細(xì)胞膜帶來的損傷，控制細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，從而提高桃果實(shí)抗冷性；而TFP處理通過抑制Ca2＋-CaM復(fù)合體的形成，加重桃果實(shí)細(xì)胞膜損傷，加劇冷害對桃果實(shí)的傷害。

2.4 鈣和鈣調(diào)素拮抗劑處理對桃果實(shí)貯藏期間VC含量的影響

圖1 鈣和鈣調(diào)素拮抗劑處理對桃果實(shí)冷藏過程中VC含量的影響Fig.1 Effects of calcium and trif l uoperazin treatments on the content of VC in cold-stored peach fruit

如圖4所示，各處理組桃果實(shí)在冷藏期間VC含量總體呈下降趨勢。CaCl2處理有效抑制了VC含量的下降，其VC含量在貯藏末期顯著高于對照組和TFP處理組（P＜0.05），在貯藏第35天，CaCl2處理組VC含量為對照組的1.43 倍；而TFP處理組VC含量在貯藏前28 d低于對照組，至貯藏結(jié)束時(shí)基本與對照組持平。

2.5 鈣和鈣調(diào)素拮抗劑處理對桃果實(shí)貯藏期間抗氧化酶活力的影響

SOD、CAT、APX是果實(shí)組織中清除活性氧自由基的抗氧化酶類。桃果實(shí)在5 ℃貯藏期間，對照組SOD活力在貯藏期間表現(xiàn)出先略微上升而后逐漸趨于平緩的趨勢（圖5A），CAT活力在貯藏前7 d有所上升隨后呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢（圖5B），APX活力在貯藏前14 d上升，隨后不斷下降（圖5C）。CaCl2處理組桃果實(shí)SOD、CAT和APX活力在整個(gè)貯藏期間都顯著高于對照組（P＜0.05），且其SOD活力至貯藏結(jié)束時(shí)仍高于采摘當(dāng)天；與對照組相比，TFP處理在貯藏7 d之后顯著抑制了桃果實(shí)SOD、CAT和APX活力（P＜0.05）。貯藏的第35天，CaCl2處理組SOD、CAT和APX活力分別比對照組高13.50%、25.52%和19.77%，而TFP處理組SOD、CAT和APX活力分別比對照組低19.6%、21.4%和8.1%。這表明Ca2＋處理能促進(jìn)Ca2＋-CaM復(fù)合體的形成，提高活性氧代謝酶活力，緩解低溫脅迫給細(xì)胞帶來的損傷，從而提高桃果實(shí)抗冷性；而TFP處理通過抑制Ca2＋-CaM復(fù)合體的形成降低了SOD、CAT和APX活力，從而加劇冷害對桃果實(shí)的傷害。

圖5 鈣和鈣調(diào)素拮抗劑處理對桃果實(shí)冷藏過程中SOD（A）、CAT（B）、APX（C）活力的影響Fig.5 Effects of calcium and trif l uoperazin treatments on SOD （A）,CAT （B） and APX （C） activities in cold-stored peach fruit

2.6 鈣和鈣調(diào)素拮抗劑處理對桃果實(shí)貯藏期間O2－·產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

由圖6A、B可以看出，桃果實(shí)O2－·產(chǎn)生速率和H2O2含量在整個(gè)貯藏期間呈現(xiàn)總體上升趨勢。對照組和TFP處理組O2－·產(chǎn)生速率在前7 d上升，隨后下降，之后再持續(xù)上升，CaCl2處理組則在前7 d略微下降，隨后緩慢上升，CaCl2處理組整個(gè)貯藏過程中O2－·產(chǎn)生速率均顯著低于對照組（P＜0.05）。對照組H2O2含量總體呈現(xiàn)上升趨勢，CaCl2處理組H2O2含量顯著低于對照組（P＜0.05），TFP處理組在貯藏7 d后，H2O2含量顯著高于對照組和CaCl2處理組（P＜0.05）。說明CaCl2處理增加了桃果實(shí)內(nèi)Ca2＋濃度，促進(jìn)了Ca2＋-CaM復(fù)合體的形成，能減少活性氧自由基的積累和傷害，提高桃果實(shí)抗冷性；而TFP處理通過抑制Ca2＋-CaM復(fù)合體的形成，在貯藏中后期顯著提高了這兩種活性氧自由基的積累，加劇了對桃果實(shí)組織的傷害。

圖6 鈣和鈣調(diào)素拮抗劑處理對桃果實(shí)冷藏過程中O－2·產(chǎn)生速率（A）和H2O2含量（B）的影響Fig.6 Effects of calcium and tri fl uoperazin treatments on O2-·production rate （A） and H2O2 content （B） in cold-stored peach fruit

2.7 鈣和鈣調(diào)素拮抗劑處理對桃果實(shí)貯藏期間脯氨酸含量和P5CS、PDH、OAT活力的影響

圖7 鈣和鈣調(diào)素拮抗劑處理對桃果實(shí)冷藏過程中脯氨酸含量（A）和P5CS（B）、OAT（C）、PDH（D）活力的影響Fig.7 Effects of calcium and trif l uoperazin treatments on proline content （A） and P5CS （B）, OAT （C） and PDH （D） activities in cold-stored peach fruit

由圖7A可知，在冷藏期間，桃果實(shí)中脯氨酸含量大體上呈逐漸增加的趨勢；與對照組相比，CaCl2處理顯著提高了貯藏后期脯氨酸的積累量（P＜0.05），而TFP處理則降低了貯藏過程中脯氨酸的積累量；貯藏第35天時(shí)，Ca2＋處理組脯氨酸含量比TFP組高11.7%。由圖7B可知，P5CS活力在貯藏前21 d呈上升趨勢，而后略有下降；與對照組相比，CaCl2處理顯著提高了桃果實(shí)中P5CS活力（P＜0.05），而TFP處理顯著抑制了貯藏中后期P5CS活力（P＜0.05）；貯藏第35天，CaCl2處理組P5CS活力比對照組提高了17.5%。由圖7C可知，所有組桃果實(shí)OAT活力在貯藏前14 d急劇上升，隨后逐漸下降；與對照組相比，貯藏前期CaCl2處理顯著提高了桃果實(shí)中OAT活力（P＜0.05），而TFP處理組在整個(gè)貯藏期間抑制OAT活力。由圖7D可知，PDH活力在冷藏期間大體上呈下降趨勢；與對照組相比，CaCl2處理在貯藏21 d后顯著抑制了PDH活力（P＜0.05），而整個(gè)貯藏期間TFP組桃果實(shí)的PDH活力均高于對照組。

以上結(jié)果表明CaCl2處理能促進(jìn)Ca2＋-CaM復(fù)合體的形成，提高P5CS和OAT活力并且降低PDH活力，促使脯氨酸積累量增加，從而提高桃果實(shí)抗冷性；而TFP處理通過抑制Ca2＋-CaM復(fù)合體的形成提高PDH活力，降低P5CS和OAT活力，阻礙脯氨酸的積累，從而加劇冷害對桃果實(shí)的傷害。

2.8 鈣和鈣調(diào)素拮抗劑處理對桃果實(shí)貯藏期間GSH含量和GR活力的影響

如圖8A所示，在冷藏期間，桃果實(shí)中GSH含量總體呈上升趨勢，至貯藏結(jié)束時(shí)，各處理組GSH含量均比初始值高；CaCl2處理組桃果實(shí)中GSH含量在第28天達(dá)到最大，比此時(shí)對照組高44.3%；TFP處理組桃果實(shí)中GSH含量在貯藏21 d后顯著低于對照組和CaCl2處理組（P＜0.05）。如圖8B所示，對照組和TFP處理組桃果實(shí)中GR活力總體呈逐漸上升趨勢，CaCl2處理組在貯藏第28天時(shí)達(dá)到最大，隨后下降；CaCl2處理組桃果實(shí)GR活力在貯藏后期顯著高于對照組（P＜0.05），整個(gè)貯藏期間TFP處理組GR活力低于對照組，但沒有顯著性差異。這表明CaCl2處理促進(jìn)Ca2＋-CaM復(fù)合體的形成，通過提高GR活力增加GSH含量，從而提高桃果實(shí)抗冷性；而TFP處理通過抑制Ca2＋-CaM復(fù)合體的形成，抑制GR活力，減少GSH含量，從而加劇冷害對桃果實(shí)的傷害。

圖8 鈣和鈣調(diào)素拮抗劑處理對桃果實(shí)冷藏過程中GSH含量（A）和GR活力（B）的影響Fig.8 Effects of calcium and trif l uoperazin treatments on GSH content （A）and GR activity （B） in cold-stored peach fruit

3 討 論

近年來，對Ca2＋-CaM復(fù)合體進(jìn)行抗逆性研究多是利用添加外源鈣和鈣調(diào)素拮抗劑，如高洪波等[14]用Ca2＋處理茄子幼苗，發(fā)現(xiàn)其有利于降低電解質(zhì)滲透率和提高SOD等酶活力，而用鈣調(diào)素拮抗劑W7處理效果則相反。張化生[28]研究發(fā)現(xiàn)分別用外源Ca2＋和W7處理后的辣椒幼苗在可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量方面的表現(xiàn)正好相反。本研究發(fā)現(xiàn)，Ca2＋處理能有效抑制桃果實(shí)冷藏期間果心褐變的發(fā)生，保持果實(shí)硬度、TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)和VC含量，延緩果實(shí)軟化衰老和果肉絮狀敗壞進(jìn)程，對提高果實(shí)抗冷性有明顯效果；而TFP處理加劇了桃果肉褐變程度，加速了果實(shí)的衰老和敗壞，表明Ca2＋-CaM復(fù)合體參與桃果實(shí)抵御低溫的過程，且Ca2＋-CaM復(fù)合體的形成有助于提高桃果實(shí)的抗冷性。

桃果實(shí)對低溫極其敏感，一般情況下，由于長時(shí)間不適宜的低溫（高于冰點(diǎn)溫度）貯藏而引起冷害，造成果肉細(xì)胞生理失調(diào)，出現(xiàn)果心褐變、果肉絮敗等典型冷害癥狀。冷害使果實(shí)細(xì)胞膜遭受破壞，影響活性氧自由基代謝平衡，產(chǎn)生大量的O2－·和H2O2，加劇細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用和細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)損傷，破壞膜區(qū)域化分布的體系，使膜透性上升，積累大量MDA[29]。VC-GSH循環(huán)是植物體內(nèi)存在的重要抗氧化系統(tǒng)，它同其他活性氧清除系統(tǒng)協(xié)同作用從而清除植物體內(nèi)積累的活性氧自由基。被光合作用還原的NADPH在GR作用下，能將氧化型谷胱甘肽還原為還原型GSH，從而經(jīng)過一系列反應(yīng)，最終達(dá)到清除活性氧自由基的目的[30]。本研究認(rèn)為，Ca2＋濃度的增加有助于保證植物細(xì)胞生物膜的完整性，維持活性氧代謝的平衡，減少膜脂過氧化的發(fā)生，從而抑制膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的積累和電導(dǎo)率的上升，提高GR活力和GSH含量的積累，延緩H2O2含量和O2－·產(chǎn)生速率的增加。這些結(jié)果表明Ca2＋-CaM復(fù)合體參與調(diào)節(jié)桃果實(shí)酶促褐變反應(yīng)，通過保持細(xì)胞膜完整性，及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)積累的活性氧自由基，從而控制桃果實(shí)褐變程度。

果實(shí)低溫貯藏期間的冷害作用與體內(nèi)的活性氧代謝失衡以及膜損傷密切相關(guān)。低溫脅迫對桃果實(shí)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和厚度發(fā)生變化有所影響，打破了細(xì)胞內(nèi)自由基清除與產(chǎn)生之間的動態(tài)平衡，使組織衰老加劇。細(xì)胞內(nèi)積累的O2－·、H2O2和羥自由基等會引起膜脂過氧化和脫脂化作用，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能[31]。果實(shí)的酶促系統(tǒng)由活性氧代謝酶類和產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)的相關(guān)酶組成，SOD、POD、CAT和APX是活氧代謝中的重要酶類。在植物抗氧化酶系統(tǒng)中，SOD能通過歧化反應(yīng)將O2－·歧化成H2O2，是抵御活性氧的第一道防線，最大程度限制活性氧與H2O2形成羥自由基，減少因活性氧積累而對細(xì)胞膜系統(tǒng)造成的傷害[32]；隨后細(xì)胞內(nèi)的H2O2又在CAT專一催化作用下將H2O2分解成H2O，最終變?yōu)镺2；POD也能將H2O2分解為H2O和O2；APX能催化H2O2和VC反應(yīng)，經(jīng)VC-GSH循環(huán)將其分解成H2O，提高細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的還原勢，從而減輕H2O2對細(xì)胞造成的氧化傷害。這3 種酶在植物體內(nèi)相互協(xié)調(diào)，將植物體內(nèi)積累的O2－·和H2O2及時(shí)分解清除，使活性氧含量處于較低水平，保持一種動態(tài)平衡，防止其對細(xì)胞的毒害[33-35]。Ca2＋能夠通過自身濃度的變化穩(wěn)定雙脂層的基本結(jié)構(gòu)、減少膜損傷和滲透，對保持細(xì)胞膜完整性起著積極作用[31]。CaM是真核細(xì)胞內(nèi)高度保守和廣泛存在的一類重要的Ca2＋受體蛋白，盡管它本身不具有活力，但能與Ca2＋結(jié)合形成Ca2＋-CaM復(fù)合體從而調(diào)節(jié)一系列靶蛋白的活性，對植物的生理功能進(jìn)行調(diào)控。Ca2＋與受體CaM結(jié)合后會引發(fā)如POD、SOD、APX、ATPase等酶活力增強(qiáng)以及內(nèi)源保護(hù)性物質(zhì)含量增加等與增強(qiáng)耐冷性有關(guān)的一系列生理反應(yīng)[36-37]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低溫脅迫下桃果實(shí)體內(nèi)活性氧代謝相關(guān)酶活力升高是對低溫脅迫的一種自我應(yīng)急反應(yīng)，桃果實(shí)采后SOD、CAT和APX活力總體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，Ca2＋處理有效提高了桃果實(shí)較高的活性氧代謝相關(guān)酶（SOD、CAT、APX）活力，及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)的O2－·和H2O2，維持果實(shí)在低溫環(huán)境下的活性氧代謝平衡；而TFP處理使低溫脅迫后的桃果實(shí)SOD、CAT、APX活力下降，積累大量的O2－·和H2O2。這表明Ca2＋-CaM復(fù)合體的形成數(shù)量對活性氧代謝相關(guān)酶活力的調(diào)節(jié)程度有所不同，該復(fù)合體參與并調(diào)控桃果實(shí)的抗冷能力，這與張化生[28]的研究結(jié)果一致。本研究認(rèn)為，Ca2＋-CaM復(fù)合體在桃果實(shí)抗冷過程中通過調(diào)節(jié)活性氧代謝相關(guān)酶活力，從而調(diào)控桃果實(shí)的抗冷能力。添加Ca2＋使類脂排列緊密，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，增加了Ca2＋-CaM復(fù)合體的形成數(shù)量，提高了活性氧代謝相關(guān)酶類對Ca2＋-CaM復(fù)合體的親和力；TFP則阻礙Ca2＋-CaM復(fù)合體的形成，阻斷由于外界刺激而產(chǎn)生的信號傳遞，影響細(xì)胞自身的生理調(diào)節(jié)。

脯氨酸是細(xì)胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對維持逆境脅迫下細(xì)胞的滲透平衡具有重要作用。P5CS和OAT分別是脯氨酸兩條合成途徑過程中的關(guān)鍵酶，而PDH是催化脯氨酸降解的一種酶，在這3 種酶的相互作用下，脯氨酸在植物體內(nèi)的合成與降解形成一個(gè)動態(tài)的調(diào)節(jié)和控制[19]。本研究認(rèn)為，Ca2＋處理誘導(dǎo)了P5CS和OAT兩者的活力，同時(shí)抑制了PDH的活力，從而增加了桃果實(shí)中脯氨酸含量的積累，而TFP處理則相反。這表明Ca2＋-CaM復(fù)合體參與桃果實(shí)中滲透物質(zhì)脯氨酸的調(diào)節(jié)和控制，進(jìn)而影響冷藏桃果實(shí)的抗冷性。Ca2＋-CaM復(fù)合體在冷害過程中的作用機(jī)制總結(jié)如圖9所示。

圖9 Ca2＋-CaM復(fù)合體在冷害過程中的作用機(jī)制Fig.9 A simpli fi ed hypothetical model for the mechanism of Ca2+-CaM complex in chilling injury

4 結(jié) 論

Ca2＋-CaM復(fù)合體參與了桃果實(shí)的抗冷調(diào)節(jié)過程。Ca2＋處理能有效緩解低溫脅迫對采后桃果實(shí)的冷害，而TFP處理則加劇了這種傷害，說明Ca2＋增強(qiáng)桃果實(shí)抗冷性的作用和增加Ca2＋-CaM復(fù)合體的形成密切相關(guān)。TFP處理后，果實(shí)內(nèi)Ca2＋-CaM復(fù)合體形成受阻，導(dǎo)致其功能發(fā)生障礙，說明Ca2＋-CaM復(fù)合體參與了桃果實(shí)抗冷過程，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受到限制，果實(shí)不能及時(shí)對低溫脅迫的刺激作出有效反應(yīng)，導(dǎo)致低溫對桃果實(shí)進(jìn)一步傷害。Ca2＋-CaM復(fù)合體對低溫脅迫下桃果實(shí)抗冷性具有調(diào)控作用，它通過調(diào)節(jié)低溫脅迫下桃果實(shí)抗氧化系統(tǒng)，從而減輕桃果實(shí)的低溫冷害，同時(shí)較好地保持了桃果實(shí)品質(zhì)并延長了貯藏期。