王嘉怡，潘姝璇，夏 陳，鄧海云，呂曉華*，陳 建,*

（1.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

發(fā)芽糙米是糙米在合適的溫度、濕度及營養(yǎng)素條件下發(fā)生種子萌發(fā)后經(jīng)加工干燥得到的活性糙米。糙米發(fā)芽的生理過程激活和釋放了其中纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、植酸酶等各種生物酶[1]，進(jìn)而催化淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、維生素等營養(yǎng)成分以及γ-氨基丁酸（gammaaminobutyric acid，GABA）等功能活性物質(zhì)的代謝轉(zhuǎn)化或積聚[2]。因而相較于糙米，發(fā)芽糙米的健康功能得到提高，食用的口感和風(fēng)味也得以改善。糙米除去胚乳（白米部分，主要含淀粉），即得米糠。米糠包含了糙米主要的功能活性物質(zhì)及部分營養(yǎng)成分[3]，是具有調(diào)節(jié)血壓、緩解心率[4]、降血糖和血脂[5-9]、保護(hù)神經(jīng)[10]、改善腸代謝、抗腫瘤[11]等健康作用的食藥同源物質(zhì)。

發(fā)芽糙米去除胚乳部分就得到發(fā)芽糙米米糠（germinated brown rice bran，GBRB）。由于經(jīng)歷了糙米的生理活化過程，GBRB中的活性物質(zhì)及營養(yǎng)成分也會(huì)有一定的特點(diǎn)。此前鮮見對(duì)GBRB的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了GBRB中營養(yǎng)成分、重金屬和功能活性物質(zhì)GABA的含量，探究了其抗疲勞功效，為發(fā)芽糙米的精深加工及功能食品開發(fā)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SD大鼠（SPF級(jí)），購于成都達(dá)碩生物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK（川）2015-030，體質(zhì)量為（280±20）g，共60 只；基礎(chǔ)飼料購于成都達(dá)碩生物科技有限公司。

發(fā)芽糙米由東北某產(chǎn)糙谷物公司制備。GABA標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%） 美國Sigma公司；甲醇、乙腈、乙醇（色譜純） 北京Mreda公司；乙酸鈉、異丙醇成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 Infinity高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配置G1311B四元梯度泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣儀、G1316A柱溫箱、G13150紫外檢測(cè)器）美國Agilent公司；AA-240FS火焰原子吸收分光光度計(jì)美國Varian公司；K9840凱氏定氮儀 山東海能科技有限公司；835-50型氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 GBRB的制備

采用常用碾米機(jī)，用一般糙米碾磨制白米的工藝，將100 kg發(fā)芽糙米碾米去除胚乳部分（白米），剩余物即為GBRB。

1.3.2 GBRB營養(yǎng)成分、無機(jī)元素及重金屬含量的測(cè)定

水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》；灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定參照GB/T 6438—2007《飼料中粗灰分的測(cè)定》；粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定參照GB/T 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》；粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定參照GB 5009.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定參照GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測(cè)定》；淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定參照GB/T 5006—1985《谷物籽粒粗淀粉測(cè)定法》；氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定參照GB/T 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》；鉀、鈉含量測(cè)定參照GB/T 5009.91—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鉀、鈉的測(cè)定》；總磷含量測(cè)定參照GB/T 5009.87—2003《食品中磷的測(cè)定》；硒含量測(cè)定參照GB/T 5009.93—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒的測(cè)定》；鐵、鈣、銅、鋅、鎂、錳含量測(cè)定分別參照GB 5009.90—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鐵的測(cè)定》、GB 5009.92—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鈣的測(cè)定》、GB 5009.13—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中銅的測(cè)定》、GB 5009.14—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鋅的測(cè)定》、GB 5009.241—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鎂的測(cè)定》、GB 5009.242—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中錳的測(cè)定》；鉛含量測(cè)定參照GB 5009.12—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鉛的測(cè)定》；鎘含量測(cè)定參照GB 5009.15—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鎘的測(cè)定》；總汞含量測(cè)定參照GB/T 5009.17—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總汞及有機(jī)汞的測(cè)定》；總砷含量測(cè)定參照GB/T 5009.11—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無機(jī)砷的測(cè)定》。

1.3.3 GBRB中GABA含量的HPLC法測(cè)定

準(zhǔn)確稱取GABA標(biāo)準(zhǔn)品10.3 mg于25 mL容量瓶中以超純水溶解并定容，用超純水稀釋為梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。準(zhǔn)確稱取GBRB 5.00 g，以體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液為提取液，液料比為5∶1，60 ℃超聲波輔助提取1 h后離心，上清液為GABA樣品溶液。

衍生化試劑為20 mg鄰苯二甲醛、1 mL甲醇、100 μL β-巰基乙醇、4 mL（pH 9.5）硼酸緩沖液，溶解即得。樣品衍生化：取樣品溶液300 μL、衍生化試劑150 μL，反應(yīng)4.5 min后加入300 μL磷酸二氫鈉溶液（0.1 mol/L）終止反應(yīng)，反應(yīng)液以0.22 μm濾膜過濾后用于測(cè)定。

色譜條件：色譜柱為IORBAX Eclipse XDB-C18Analytica（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為乙酸鈉溶液（25 mmol/L），B為乙腈；并從0 min（流動(dòng)相A、B體積比為90∶10）至15 min（流動(dòng)相A、B體積比為65∶35）梯度洗脫；流速為1.1 mL/min；紫外檢測(cè)波長為332 nm；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中，動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。將50 只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)均分成5 組，即空白對(duì)照組、高脂對(duì)照組和GBRB低、中、高劑量組，每組10 只?？瞻讓?duì)照組動(dòng)物喂飼基礎(chǔ)飼料，高脂對(duì)照組飼喂高脂飼料，3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物分別喂飼對(duì)應(yīng)低、中、高劑量GBRB飼料（動(dòng)物飼料配方見表1）?？刂聘鹘M動(dòng)物進(jìn)食量及飲水量基本一致，持續(xù)83 d。每周記錄進(jìn)食量和體質(zhì)量。

表1 動(dòng)物飼料配方Table1 Formulation of experimental diets%

喂飼實(shí)驗(yàn)第83天，將大鼠禁食16 h，稱量大鼠體質(zhì)量，并按其體質(zhì)量的5%在頸部以鉛皮負(fù)重。將大鼠置于直徑1 m、水深0.5 m、水溫25 ℃的水槽中，記錄大鼠從游泳開始至力竭沉入水中5 s無力浮出水面的時(shí)間，作為游泳力竭時(shí)間。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 GBRB得率分析

發(fā)芽糙米經(jīng)碾磨去除胚乳部分（即白米部分，主要是淀粉），得到GBRB 33.6 kg，出糠率為33.6%。由于碾米時(shí)發(fā)芽糙米米粒易碎，因此得到的GBRB中混入了部分不易篩出的碎米粉，導(dǎo)致出糠率比普通糙米的（約5.4%～9.0%[12-13]）要高。

2.2 GBRB中營養(yǎng)成分、無機(jī)元素及重金屬的含量分析

2.2.1 GBRB中的營養(yǎng)成分含量分析

表2 GBRB營養(yǎng)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table2 Nutrient contents in GBRB

如表2所示，GBRB的粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.0%，相較于文獻(xiàn)[14-16,20]報(bào)道的普通米糠中粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍3.2%～10.6%，GBRB的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于此范圍的最大值。GBRB的粗脂肪含量為8.45%，在文獻(xiàn)[14-16]報(bào)道的普通米糠的粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍（14.5%～16.4%）之間。GBRB中粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2.9%）不到普通米糠（9.9%～10%）[14-15]的29%，這可能是糙米在發(fā)芽過程中，相關(guān)纖維素酶的作用致使粗纖維斷裂成可溶性小碎片或小分子質(zhì)量的多糖，因此可測(cè)定的粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏低。而且GBRB中灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（3.2%）不到普通米糠中的灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（9.6%～10.2%）[14-16]的33%，這很可能是因?yàn)榘l(fā)芽過程激活了植酸酶，其中菲?。ㄖ菜徕}鎂，又稱肌醇六磷酸鈣鎂）被酶解分解釋放出肌醇、大量磷酸鈣鹽及少量鎂鹽，這些無機(jī)鹽可溶于發(fā)芽浸泡水流失，因而檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GBRB經(jīng)燃燒后剩余的無機(jī)灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少很多。這些數(shù)據(jù)也表明，糙米經(jīng)發(fā)芽過程確實(shí)激活了有關(guān)的酶，酶再作用于相關(guān)底物致其活化、分解，或產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，進(jìn)而使發(fā)芽糙米有更好的功能活性。另外，測(cè)定的GBRB中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為53.6%，主要由于發(fā)芽糙米碾米時(shí)易碎，GBRB中很容易混入碎米細(xì)粉，因此測(cè)得的淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。

2.2.2 GBRB中的氨基酸含量分析

GBRB氨基酸分析如表3所示。總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.2%，略低于文獻(xiàn)[21-22]報(bào)道的普通米糠中總氨基酸11.76%～11.80%的范圍，這與粗蛋白的含量情況一致（表2），主要因?yàn)榘被岱治龆嘣从诘鞍踪|(zhì)的水解。在所測(cè)定的17 種單一氨基酸中，天冬氨酸（0.98%）、谷氨酸（1.60%）、賴氨酸（0.46%）的含量略高于普通米糠相應(yīng)氨基酸的含量[11]（分別為0.85%、1.08%、0.37%）。其余的13 種氨基酸在文獻(xiàn)報(bào)道的普通米糠中對(duì)應(yīng)氨基酸含量范圍內(nèi)或略低。GBRB中的胱氨酸（0.14%）在普通米糠中鮮有發(fā)現(xiàn)。同時(shí)GBRB也含有必需氨基酸：異亮氨酸（0.42%）、賴氨酸（0.45%）、組氨酸（0.33%）。

表3 GBRB中氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table3 Amino acid contents in GBRB%

2.2.3 GBRB中無機(jī)元素含量分析

GBRB中鉀、鈉、鐵、鋅、錳、鈣、鎂、硒、磷、銅10 種無機(jī)元素含量見表4，這些元素含量都低于文獻(xiàn)[15,20]報(bào)道的普通米糠中相應(yīng)元素含量，這可能因?yàn)橛嘘P(guān)無機(jī)鹽在糙米浸泡發(fā)芽過程中溶解于水而流失，也可能跟稻谷品種及種植條件有關(guān)。

表1 GBRB中無機(jī)元素含量Table1 Mineral contents in GBRB mg/kg

2.2.4 GBRB中重金屬含量分析

表5 GBRB中重金屬含量Table5 Heavy metal contents in GBRB mg/kg

測(cè)定了GBRB中汞（0.0031 mg/kg）、砷（0.32 mg/kg）、鉛（0.18 mg/kg）、鎘（0.022 mg/kg）4 種重金屬含量，結(jié)果如表5所示。參考GB 2762—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》，本實(shí)驗(yàn)的GBRB中重金屬含量完全在安全食用限量范圍內(nèi)，汞甚至比限量標(biāo)準(zhǔn)（0.02 mg/kg）低83%，鎘比限量標(biāo)準(zhǔn)（0.1 mg/kg）低78%，表明GBRB安全可食。有報(bào)道普通米糠常因重金屬含量超標(biāo)而不適合食用[23]，因此稻谷品種、種植地、種植方法及發(fā)芽制備和后處理過程是制備能安全食用GBRB的重要控制因素。

2.3 GABA的HPLC分析

2.3.1 HPLC分析條件

本實(shí)驗(yàn)探索的HPLC方法的化學(xué)衍生、流動(dòng)相、洗脫梯度等條件與文獻(xiàn)[24]報(bào)道的都不同。應(yīng)用本法對(duì)GBRB中的GABA進(jìn)行測(cè)定，HPLC圖譜如圖1所示。GABA標(biāo)準(zhǔn)品及GBRB樣品中GABA的出峰時(shí)間都是11.4 min左右，比文獻(xiàn)[24-25]報(bào)道的HPLC法測(cè)試GBAB的出峰時(shí)間（18 min）早，并且在此條件下，GABA得到較好分離，峰形尖銳。

圖 1 GBRB樣品及GABA標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms for GBRB and GABA standard

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系

將1.3.3節(jié)中配制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液進(jìn)行HPLC分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝8 961.6x－140.7（R2＝0.999 9，n＝6），證明線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度分析

將樣品按1.3.2節(jié)制備樣品溶液，共4 份，每份測(cè)定6 次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.07%、1.25%、1.85%、1.52%，表明該方法精密度良好。

2.3.4 加標(biāo)回收率分析

表6 GABA加標(biāo)回收率Table6 Recoveries of GABA from spiked samples

向已知濃度樣品中分別加入GABA標(biāo)準(zhǔn)品，按1.3.3節(jié)制備樣品溶液，進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果見表6。平均加標(biāo)回收率為99.61%，RSD為1.46%（n＝6）。該方法具有良好的回收率，結(jié)果可靠性高。2.3.5 GABA含量及重復(fù)性分析

將樣品按1.3.2節(jié)制備樣品溶液，共4 份，測(cè)定每份樣品含量，平均含量為53 mg/100 g，其RSD為1.90%，重復(fù)性良好。發(fā)芽糙米的特點(diǎn)之一是其中GABA含量增加[26]。本研究的起始原料源于工廠生產(chǎn)制備的發(fā)芽糙米，而非實(shí)驗(yàn)室小量制備，因此與參考文獻(xiàn)[25,27]報(bào)道的小量制備的發(fā)芽糙米中GABA含量（分別為22.68～88.36、12.77～24.89 mg/100 g）相比較，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的GBRB中GABA含量較高，且有一定代表性。

2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析

2.4.1 大鼠的體質(zhì)量變化分析

各組實(shí)驗(yàn)大鼠的初體質(zhì)量、終體質(zhì)量及增體質(zhì)量如表7所示。實(shí)驗(yàn)過程中，大鼠的活動(dòng)狀態(tài)及攝食飲水能力均正常。各組大鼠體質(zhì)量的增加相對(duì)空白對(duì)照組都沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異（P＞0.05）。說明食用GBRB對(duì)大鼠的正常生長發(fā)育無不良影響。

表7 實(shí)驗(yàn)大鼠的體質(zhì)量變化（n＝10）Table7 Variation in body mass of rats from all groups （n= 10）

2.4.2 GBRB的抗疲勞作用分析

抗疲勞功效常用動(dòng)物的負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)[27]，因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)耐力的提高是抗疲勞能力加強(qiáng)最直接的表現(xiàn)，游泳時(shí)間的長短可以反映動(dòng)物運(yùn)動(dòng)疲勞的程度。本研究采用大鼠的負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)的游泳力竭時(shí)間來評(píng)價(jià)GBRB的抗疲勞功效。大鼠經(jīng)高、中、低劑量GBRB灌胃后，測(cè)試其負(fù)重游泳力竭的時(shí)間，并與空白及高脂組進(jìn)行對(duì)照（表8）。與空白對(duì)照組相比，高劑量組大鼠的游泳時(shí)間顯著延長（P＜0.05），中、低劑量組沒有顯著差異，說明大鼠食用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)30% GBRB的飼料后，其運(yùn)動(dòng)耐力顯著提高。這個(gè)結(jié)果提示在常規(guī)飼料中加入適當(dāng)比例的GBRB，有利于體質(zhì)的綜合健康，進(jìn)而增強(qiáng)抗疲勞的能力。高脂對(duì)照組大鼠的游泳時(shí)間則顯著短于空白對(duì)照組（P＜0.05），說明食用含高脂的飼料有損運(yùn)動(dòng)能力。而高、中、低劑量3 組大鼠游泳時(shí)間都顯著長于高脂組大鼠（P＜0.05），說明食用GBRB可以緩解或彌補(bǔ)大鼠食用高脂飼料導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)能力下降。

表8 GBRB抗疲勞的效果（n＝10）Table8 Anti-fatigue activity of GBRB （n= 10）

實(shí)驗(yàn)大鼠喂食GBRB后負(fù)重游泳時(shí)間明顯延長，提示食用GBRB能夠增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力，緩解疲勞。GBRB體現(xiàn)出緩解疲勞功效，與其包含的營養(yǎng)成分相關(guān)，也與其中功能活性物質(zhì)相關(guān)，特別是本研究測(cè)得GABA含量達(dá)53 mg/100 g。GABA能促進(jìn)小鼠生長激素（growth hormone，GH）的分泌，增加小鼠肝糖原的儲(chǔ)存。糖原是維持運(yùn)動(dòng)的主要能源物質(zhì)，GH能增加葡萄糖異生作用，減少糖的消耗，增加糖原儲(chǔ)備[28]。因而GABA能提高運(yùn)動(dòng)能力，具有一定的抗疲勞作用[29]。另外，GBRB中的谷胱甘肽[30]、二十八烷醇[31-32]、阿片樣肽[33-34]等具有抗疲勞作用的活性物質(zhì)也可能與GABA產(chǎn)生協(xié)同作用，促進(jìn)了GBRB緩解大鼠的運(yùn)動(dòng)疲勞。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)源于工業(yè)規(guī)模GBRB的營養(yǎng)成分、無機(jī)元素及重金屬含量進(jìn)行了檢測(cè)分析。結(jié)果表明GBRB的粗纖維、灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別不到普通米糠的29%、33%，這應(yīng)當(dāng)正是經(jīng)發(fā)芽過程和經(jīng)纖維素酶、植酸酶等酶促作用的結(jié)果。GBRB中粗蛋白、總氨基酸及單一氨基酸（除胱氨酸）、粗脂肪與普通米糠中的含量相近。經(jīng)過浸泡發(fā)芽并溶水流失，GBRB中無機(jī)元素含量都低于普通米糠。重金屬含量在我國安全食用限量以下。建立并驗(yàn)證了測(cè)定GBRB中GABA含量的HPLC方法，GABA出峰時(shí)間僅約11 min。測(cè)得發(fā)芽糙米的米糠中GABA含量達(dá)到53 mg/100 g。用含有高劑量（30%）GBRB的高脂飼料喂飼大鼠后，大鼠負(fù)重游泳至竭力時(shí)間顯著長于空白對(duì)照；喂食高（30%）、中（20%）、低（10%）劑量的GBRB還能夠提高大鼠因食用高脂飼料導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)能力下降；結(jié)果表明食用GBRB具有抗疲勞功效。

當(dāng)今社會(huì)由于生活水平提高，人們飲食中普遍攝入較多高脂肪食物，導(dǎo)致體脂過高或肥胖、心血管不良癥狀等，進(jìn)而體現(xiàn)運(yùn)動(dòng)能力下降或虛弱。GBRB具有抗疲勞功效，特別是能夠抑制高脂飲食導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)能力下降，提示GBRB可被研發(fā)成為新的功能食品。