盧 晶 沈 涵 程 呈 劉敬怡 朱曉蓉 謝榮榮 袁明霞 楊金奎

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科 糖尿病防治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京市糖尿病研究所，北京 100730)

葡萄糖代謝是機(jī)體復(fù)雜的生理過程，包括胰島素的合成、成熟、分泌等環(huán)節(jié)。生理狀態(tài)下，胰島β細(xì)胞感受機(jī)體的血糖波動，分泌胰島素，促進(jìn)肝臟、肌肉和脂肪的葡萄糖攝取，從而調(diào)節(jié)血糖至正常水平[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊、成熟和轉(zhuǎn)運(yùn)的重要細(xì)胞器，也參與細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)過程。在缺氧、氧化應(yīng)激或細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)破壞等病理?xiàng)l件下，細(xì)胞為了自我保護(hù)，啟動未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)以應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum, ER)[2]。UPR包括3條主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，分別由蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase, PERK), 激活轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6), 以及肌醇必需激酶1(inositol-requiring kinase1, IRE1)介導(dǎo)[3]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在時，細(xì)胞可以誘發(fā)UPR的終末期反應(yīng)——凋亡。已有研究[4-6]顯示，C/EBP-同源蛋白(C/EBP-homologous protein, CHOP)和IRE1下游通路參與細(xì)胞凋亡。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2, TRAF2)，凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1, ASK1)/ c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)以及半胱天冬酶半胱天冬酶12(cleaved-cysteine aspartyl protease-12，cleaved-caspase 12)的激活參與其中。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡與肝臟損傷以及糖代謝異常關(guān)系密切。

生理狀態(tài)下，胰島β細(xì)胞的葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion, GSIS)由一系列電活動調(diào)控，主要依賴于ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive K+channel， KATP)[7]。除KATP通道外，電壓門控ether-α-go-go相關(guān)基因(ether-α-go-gorelated gene, ERG)鉀通道家族也廣泛存在于胰島細(xì)胞。ERG家族屬于電壓依賴性鉀通道，有3個家族成員，分別是Kcnh2編碼的ERG1通道，Kcnh6基因編碼的ERG2通道以及Kcnh7編碼的ERG3[8]。在INS-1細(xì)胞中，ERG通道抑制劑E4031可以通過阻斷ERG通道，增加胰島素的分泌[9]。有研究[10]顯示，編碼的ERG1鉀通道參與心臟延遲整流電流。Hyltén-Cavallius等[11]的研究顯示，ERG1鉀通道突變的患者患有2型長QT間期綜合征且胰島素分泌升高。Rosati等[12]的研究顯示，ERG鉀通道在人胰島β細(xì)胞分泌胰島素的調(diào)節(jié)中具有重要作用。

然而，目前關(guān)于人ERG(human ERG, hERG)鉀通道和葡萄糖代謝關(guān)系的研究較少。本課題組發(fā)現(xiàn)一個hERG鉀通道雜合突變的糖尿病家系，家系中成年患者表現(xiàn)為低胰島素血癥和糖尿病，前期采用TALEN技術(shù)成功構(gòu)建了hERG基因敲除小鼠動物模型，發(fā)現(xiàn)敲除動物存在糖耐量異常，但其具體機(jī)制尚未完全闡明[13]。本研究將利用課題組前期構(gòu)建的hERG基因敲除動物模型進(jìn)一步探討hERG基因敲除對存在肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡的影響，以及這種影響是否導(dǎo)致了糖耐量異常。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級健康的雄性C57BL/6J小鼠，8周齡，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(京)2011-0012。采用TALEN技術(shù)構(gòu)建hERG基因敲除小鼠動物模型(C57BL/6J背景)。實(shí)驗(yàn)時，雄性hERG敲除小鼠(knockout, KO)與野生對照小鼠(wild type,WT)均為20周齡。飼養(yǎng)在環(huán)境溫度為20～24 ℃、環(huán)境濕度為50%～70%的SPF級動物房內(nèi)，正常日光周期，自由進(jìn)食及飲水，保持墊料干燥。

1.2 病理切片的制備

20周齡雄性小鼠，頸椎脫臼處死后，沿腹正中線打開腹腔，小心、迅速分離胰腺組織，將采集的胰腺置于4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛中固定24 h，以備制作石蠟切片。取出4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定24 h的胰腺和肝臟組織，梯度乙醇脫水，二甲苯中透明，將充分透明的胰腺組織塊放于融化的石蠟中，置于熔蠟箱內(nèi)保溫。石蠟完全浸入組織塊后，進(jìn)行包埋。將包埋好的胰腺組織蠟塊、肝臟組織蠟塊固定在切片機(jī)上，切成厚度為5 μm的薄片，薄片在預(yù)熱的水中燙平后貼于掛膠載玻片上，恒溫箱中烤干，以備染色用。

1.3 RNA的提取和熒光實(shí)時定量PCR

采用天根細(xì)胞組織總RNA提取試劑盒(貨號DP419)提取RNA，采用天根FastQuant cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑(貨號KR108)合成cDNA。β-actin基因作為內(nèi)參。采用Light Cycler 96儀器 (美國Roche公司)檢測RNA的表達(dá)情況。PCR反應(yīng)體系為20 μL:2×酶混合物(Transgen Biotech公司, 貨號AS111) 10 μL、正向引物1 μL(10 μmol/L)、反向引物1 μL(10 μmol/L)、 cDNA 1.5 μL、DEPC H2O 6.5 μL。擴(kuò)增條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)后再72 ℃ 7 min，自然冷卻至室溫。所用引物詳見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用引物序列Tab.1 Primers used in the experiment

1.4 Western blotting

采用BCA蛋白分析試劑盒 (中國碧云天公司)測定蛋白濃度。取80 μg總蛋白進(jìn)行10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)(200 mA，120 min)至硝酸纖維膜上。用TBST配制的5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，用封閉液將一抗稀釋后與膜在4 ℃搖床孵育過夜，次日用TBST洗膜3次，每次5 min，再與辣根過氧化物酶(horseradish Peroxidase, HRP)標(biāo)記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。TBST洗滌，滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence, ECL)發(fā)光液后用Chemi-Doc Touch凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)顯影成像，并用Image J軟件對圖像進(jìn)行灰度分析。所用抗體,詳見表2。

hERG: humanether-a-go-gorelated gene ;CHOP: C/EBP-homologous protein;caspase3: cysteine aspartyl protease 3；BIP(GRP78): binding immunoglobulin protein;ATF4: activating transcription factor 4;p-JNK: phosphorylated-c-Jun N-terminal kinase;JNK: c-Jun N-terminal kinase;Bax: Bcl2 associated X protein;Bcl2: B-cell lymphoma 2.

1.5 慢病毒感染

構(gòu)建hERG的慢病毒LV載體。12周齡的雄性KO小鼠尾靜脈一次性注射慢病毒載體，慢病毒注射劑量為KO組：LV-hERG，WT組：LV-GFP，7×104 TU/g。兩周后處死小鼠，用Western blotting法檢測小鼠肝臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與凋亡的相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 hERG敲除小鼠肝臟形態(tài)學(xué)

小鼠20周齡時，分別檢測KO小鼠及其同窩WT小鼠的體質(zhì)量及攝食量，二者差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1A、B)。小鼠頸椎脫臼處死后，分離小鼠肝臟，制備石蠟切片，行HE染色，顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，高倍鏡下，WT小鼠的肝細(xì)胞胞質(zhì)豐富，胞核呈圓形或橢圓形，偶見雙核，肝血竇清晰可見，未見明顯的病理變化；KO小鼠的肝細(xì)胞輕度腫脹，胞質(zhì)呈顆粒狀，肝血竇幾乎消失(圖1C)。

2.2 糖代謝關(guān)鍵酶在肝臟的表達(dá)

分離KO小鼠及同窩WT小鼠肝臟，Western blotting法檢測上述兩種糖異生關(guān)鍵酶在肝臟的表達(dá)，結(jié)果顯示與WT相比，葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase, G6pase)表達(dá)無明顯變化，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，提示hERG敲除可能引起肝臟糖代謝異常，詳見圖2、表3。

圖1 hERG敲除小鼠肝臟形態(tài)學(xué)Fig.1 Liver morphology of hERG knockout mice

A:weight of the mice;B: food intake of the mice;C: HE staining of the mice(100×);hERG: humanether-a-go-gorelated gene;WT: wide type;KO: knockout;n=6.

圖2 Western blotting檢測糖異生關(guān)鍵酶在小鼠肝臟的表達(dá)Fig.2 Expression level of the gluconeogenesis related key enzyme in the liver measured with Western blotting

* *P<0.01vsWT;WT: wide type;KO: knockout;G6pase: glucose-6-phosphatase;PEPCK: phosphoenolpyruvate carboxykinase.

表3 Western blotting法檢測糖異生關(guān)鍵酶在小鼠肝臟的表達(dá)水平Tab.3 Expression level of the gluconeogenesis related key enzyme in the liver measured with Western blotting

WT: wide type;KO: knockout;G6pase: glucose-6-phosphatase;PEPCK: phosphoenolpyruvate carboxykinase.

2.3 hERG敲除小鼠肝細(xì)胞凋亡增加

為研究肝臟變化的可能機(jī)制，對小鼠肝臟進(jìn)行了凋亡相關(guān)指標(biāo)的檢測。利用Western blotting的方法檢測肝組織中，凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與WT相比，KO小鼠肝臟的半胱天冬酶半胱天冬酶3(cleaved-cysteine aspartyl protease 3，cleaved-caspase 3)，B細(xì)胞淋巴瘤因子2(B-cell lymphoma 2，Bcl2) 的表達(dá)上調(diào)和Bcl2相關(guān)X蛋白(Bcl2 associated X protein，Bax)表達(dá)下調(diào)，詳見圖3、表4。綜上，hERG敲除可以使小鼠肝細(xì)胞的凋亡增加。

圖3 Western blotting檢測小鼠肝臟凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.3 Expression level of the apoptosis-related protein in the liver measured with Western blotting

*P<0.05vsWT group,n=3;WT: wide type;KO: knockout;p-JNK: phosphorylated-c-Jun N-terminal kinase;JNK: c-Jun N-terminal kinase;Bax: Bcl2 associated X protein;Bcl2: B-cell lymphoma 2;caspase3: cysteine aspartyl protease 3.

表4 Western blotting法檢測小鼠肝臟凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平Tab.4 Expression level of the apoptosis-related protein in the liver measured with Western blotting

2.4 hERG敲除小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平增加

為進(jìn)一步研究肝細(xì)胞凋亡是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)，檢測了肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。real-time qPCR檢測結(jié)果顯示，KO小鼠的肝臟中結(jié)合免疫球蛋白的蛋白質(zhì)(binding immunoglobulin protein, BIP)、CHOP、ATF4及ATF6的mRNA上調(diào)(圖4A)。Western blotting結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，KO小鼠的肝臟中BIP(GRP78)、磷酸化真核細(xì)胞翻譯起始因子2(phosphorylated-eukaryotic translation initiation factor 2α, p-eIF2α)、ATF4以及CHOP的蛋白濃度上調(diào)(圖4B，表5)。綜上，hERG敲除小鼠的肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平上調(diào)。

圖4 小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression level of endoplasmic reticulum stress related protein in mouse liver using Western blotting

A： mRNA expression levels of stress related proteins in the liver using real-time PCR；B： protein levels of stress related proteins in the liver measured with Western blotting;*P<0.05,* *P<0.01vsWT group；hERG: humanether-a-go-gorelated gene ;WT: wide type;KO: knockout;BIP(GRP78): binding immunoglobulin protein;p-eIF2α:phosphorylated-eukaryotic translation initiation factor 2α;eIF2a: eukaryotic translation initiation factor 2α;ATF4: activating transcription factor 4;ATF6: activating transcription factor 6;CHOP: C/EBP-homologous protein.

WT: wide type;KO: knockout;hERG: humanether-a-go-gorelated gene;BIP(GRP78): binding immunoglobulin protein;eIF2a: eukaryotic translation initiation factor 2α;ATF4: activating transcription factor 4;CHOP: C/EBP-homologous protein.

2.5 hERG在體內(nèi)過表達(dá)減輕肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡

為進(jìn)一步探究hERG在體內(nèi)過表達(dá)能否改善 KO小鼠肝臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡，構(gòu)建了hERG的慢病毒載體注射到實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)，兩周后處死小鼠，用Western blotting法檢測小鼠肝臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與凋亡的相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示與注射LV-GFP的對照組小鼠相比，LV-hERG組小鼠肝臟hERG表達(dá)明顯上調(diào)，顯示模型構(gòu)建成功(圖5A)。LV-hERG組的ATF4及CHOP等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的蛋白表達(dá)水平下調(diào)，提示hERG過表達(dá)對小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有保護(hù)作用。同時，Western blotting結(jié)果顯示，凋亡相關(guān)蛋白中，Bcl2的表達(dá)有上調(diào)趨勢(P=0.09)，Bax、cleaved-caspase 3的表達(dá)下調(diào)，提示hERG過表達(dá)可改善小鼠肝細(xì)胞的凋亡(圖5B，表6)。綜上，hERG在體內(nèi)過表達(dá)可以減輕肝臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡。

圖5 Western blotting法檢測小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.5 Expression levels of endoplasmic reticulum stress and apoptosis related proteins using Western blotting

A:hERG expression level of KO mice with LV-GFP or LV-hERG;B:expression levels of endoplasmic reticulum stress and apoptosis-related proteins;*P<0.05,* *P<0.01,** *P<0.001vsLV-GFP;hERG: humanether-a-go-gorelated gene;ATF4: activating transcription factor 4;CHOP: C/EBP-homologous protein;Bcl2: B-cell lymphoma 2.Bax: Bcl2 associated X protein;caspase3: cysteine aspartyl protease 3.

3 討論

肝細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致肝臟損傷以及肝臟疾病的重要環(huán)節(jié)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中參與細(xì)胞內(nèi)跨膜蛋白與分泌蛋白合成、加工、修飾以及轉(zhuǎn)運(yùn)的重要細(xì)胞器。內(nèi)源性或外源性刺激引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊功能異常所導(dǎo)致的這種細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。Ruiz-Vela等[14]的研究顯示，?；切苋パ跄懰峥梢酝ㄟ^抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡；可以降低胡蘿卜素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子的上調(diào)，改善GRP78的過度表達(dá)，抑制Caspase12的激活，從而減輕肝細(xì)胞凋亡。

表6 Western blotting檢測小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Tab.6 Expression level of endoplasmic reticulum stress and apoptosis-related proteins in the liver measured with Western blotting

肝臟在葡萄糖代謝，尤其是糖異生過程中發(fā)揮重要作用。糖異生是指乳酸、甘油以及生糖氨基酸等簡單的非糖前體，在一系列酶的催化作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟腔蛱窃倪^程，它為機(jī)體血糖穩(wěn)態(tài)提供了重要保證。G6pase是糖異生過程的關(guān)鍵酶，通過水解葡萄糖-6-磷酸鹽生成葡萄糖，在維持機(jī)體血糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[15]。PEPCK是糖異生過程的另一種關(guān)鍵酶，在PEPCK作用下，將草酰乙酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸，經(jīng)過一系列后續(xù)反應(yīng)后最終生成葡萄糖[16]。本研究顯示，與同周齡WT小鼠相比，KO小鼠的糖異生關(guān)鍵酶PEPCK的表達(dá)上調(diào)，提示可能發(fā)生糖代謝異常，這一結(jié)果與課題組前期證實(shí)的KO小鼠存在糖耐量異常一致[13]。

KO小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、p-eIF2α、ATF4和CHOP的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)上調(diào)；凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3、Bax的表達(dá)上調(diào)，Bcl2表達(dá)下調(diào)。這一結(jié)果提示KO小鼠體內(nèi)存在肝臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡。經(jīng)尾靜脈向KO小鼠注射LV-hERG，Western bloting檢測結(jié)果顯示在KO小鼠體內(nèi)，注射hERG病毒的小鼠有hERG基因表達(dá)，而注射GFP基因的小鼠體內(nèi)沒有hERG表達(dá)，說明模型構(gòu)建成功。結(jié)果顯示體內(nèi)過表達(dá)hERG可以下調(diào)ATF4、CHOP、cleaved-caspase3等蛋白的表達(dá)。綜上，hERG可以通過改善肝臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與凋亡從而調(diào)節(jié)糖代謝。

本研究的局限性在于，沒有找到hERG與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的直接作用媒介以明確闡明hERG對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡保護(hù)作用的機(jī)制。在后期的研究中，擬考慮通過免疫共沉淀等方法，尋找與hERG直接作用的分子。但可以明確的是，hERG對肝臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡具有保護(hù)作用，進(jìn)而發(fā)揮改善糖代謝的作用。本研究可以為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣耗竭誘導(dǎo)的β細(xì)胞功能障礙的原因和hERG激動劑治療糖尿病的可能性提供新的見解。