祁長波 常 娜 楊 琳 李麗英

(首都醫(yī)科大學(xué)細胞生物學(xué)系‘肝臟保護與再生調(diào)節(jié)’北京市重點實驗室，北京 100069)

在肝纖維化/肝硬化的過程中，肝臟肌成纖維細胞(hepatic myofibroblasts，hMFs)合成大量細胞外基質(zhì)成分，致使其在肝臟中過量沉積，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[1]。有文獻[2]報道，hMFs具異質(zhì)性，而肝臟星形細胞(hepatic stellate cells, HSCs)，是其重要來源之一，在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中至關(guān)重要。肝損傷發(fā)生時，HSCs活化，轉(zhuǎn)變成hMFs。活化的HSCs導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生，因此了解HSCs活化的分子機制對闡明肝纖維化發(fā)病機制乃至轉(zhuǎn)歸尤為關(guān)鍵。本研究中筆者采用人肝臟星形細胞系(LX-2細胞)來進行相關(guān)研究。

Li等[3-6]的前期研究結(jié)果已證實鞘胺醇激酶1(sphingosine kinase 1, SphK1)及其產(chǎn)物鞘胺醇-1-磷酸(sphingosine 1-phosphate, S1P)組成的SphK1/S1P系統(tǒng)，能夠顯著影響LX-2細胞的活化及肝纖維化的發(fā)病進程。有文獻[7-8]報道，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，在HSCs活化的過程中發(fā)揮重要作用。本課題組[9-11]的前期實驗也證實，TGF-β1促進SphK1表達并以SphK1依賴的方式誘導(dǎo)細胞向hMFs活化。那么在HSCs活化的過程中，是否還有其他調(diào)控因子參與了TGF-β1調(diào)控SphK1表達的過程，目前尚不清楚。

轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是近年來基因調(diào)控研究的熱點，作為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，microRNA(miRNA)對于許多病生理過程均有重要調(diào)控作用。文獻[12-15]報道，miRNA可以通過調(diào)控不同靶基因的表達參與HSCs活化過程，并促進或抑制肝纖維化發(fā)病的進程。研究[16-19]顯示，miR-125b、miR-101、miR-506以及miR-124可在多種腫瘤發(fā)生的過程中調(diào)控SphK1表達。同時，TGF-β1也可以通過miRNA調(diào)控下游基因的表達[20-21]。例如在腎纖維化中，TGF-β1上調(diào)了細胞內(nèi)miR-21水平，且這一過程與SphK1/S1P系統(tǒng)密切相關(guān)[22]。那么miRNA是否參與了TGF-β1誘導(dǎo)的SphK1表達調(diào)控過程，進而影響HSCs活化呢？為了探究這一問題，本研究通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫miRWalk (http://129.206.7.150/)和Targetscan (http://www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測可能靶向SphK1 mRNA的miRNAs，取交集后在小鼠肝臟組織中檢測各miRNA的表達，篩選出miR-378a-5p作為研究對象，并在LX-2細胞中探究其是否能夠調(diào)控SphK1 mRNA的表達。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基(Gibico公司，美國)；胎牛血清(Excell公司，中國)；青/鏈霉素、胰蛋白酶(Gibico公司，美國)；TGF-β1(PeproTech公司，美國)；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司，美國)；TRIzol試劑及相分離管體系(TRIzol Reagent and Phasemaker Tubes Complete System)(Invitrogen公司，美國)；RNA提取純化試劑盒(Gene JET RNA Purification Kit)(Invitrogen公司，美國)；microRNA模擬物及抑制劑(micrONTM miRNA mimic/micrOFFTM miRNA inhibitor)(廣州市銳博生物科技有限公司，中國)；miRNA實時熒光定量核酸擴增檢測試劑盒(Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Kit)(廣州市銳博生物科技有限公司，中國)；SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)混合試劑(SYBR Green PCR Master Mix)(ABI公司，美國)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine RNAiMAX)(Invitrogen公司，美國)。

CO2細胞培養(yǎng)箱BB16(Heraeus公司，德國)；實時熒光定量PCR儀ABPrism 7300(ABI公司，美國)。

1.2 動物模型

采用4周齡ICR小鼠進行造模，共12只小鼠，對照組、實驗組每組各6只。查正態(tài)曲線下面積表得出把握度>0.90，符合實驗設(shè)計要求。采用數(shù)字表法將小鼠隨機分為對照組和造模組。模型組：橄欖油按照體積比1∶9稀釋四氧化碳(carbon tetrachloride, CCl4)，腹腔注射(10 mL/kg)，每周注射2次。對照組：腹腔注射相應(yīng)體積的橄欖油(olive oil, OO)。處死小鼠當(dāng)天注射最后1次。飼養(yǎng)4周完成模型制作，后處死小鼠獲取肝臟樣本，處死前禁食6 h，常規(guī)飲水。

1.3 細胞培養(yǎng)

LX-2細胞采用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。接種密度為1×106/大皿(r=10 cm)或7×105/中皿(r=6 cm)。當(dāng)細胞匯合度達到90%時進行傳代，取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.4 MicroRNA模擬物及抑制劑的轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1 d接種4×105個細胞于6 cm細胞培養(yǎng)皿，當(dāng)細胞匯合度到達50%～60%時進行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染步驟參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine RNAiMAX)說明書。MicroRNA模擬物轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L，microRNA抑制劑轉(zhuǎn)染終濃度為100 nmol/L。6～8 h后換為完全培養(yǎng)基。成熟miRNAs的序列見表1。

1.5 細胞總RNA提取

棄舊培養(yǎng)基，每中皿加500 μL TRIzol 試劑，混勻收集細胞樣品至分離管，靜止5 min；加0.2 mL氯仿，用力搖晃15 s，25 ℃靜置2～3 min；4 ℃ 12 000 g離心15 min，將最上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管；加0.5 mL的100%(體積分?jǐn)?shù))異丙醇，倒置輕輕混勻，25 ℃靜置10 min；4 ℃ 12 000 g離心10 min，棄上清；加 1 mL的75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，短暫漩渦，4 ℃ 7 500 g離心5 min，棄上清；無RNA酶潔凈空氣干燥5～10 min，加50 μL的無RNA酶水溶解，55～60 ℃孵育10 min。檢測定量進行后續(xù)反轉(zhuǎn)錄。

1.6 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)

采用RNA提取純化試劑盒(Gene JET RNA Purification Kit)提取細胞RNA。檢測定量后取1 μg RNA進行反轉(zhuǎn)錄(不加反轉(zhuǎn)錄酶作為陰性對照，即No-RT)。采用反轉(zhuǎn)錄后的cDNA原液進行相應(yīng)倍數(shù)的稀釋，進行qPCR。該過程中使用的引物序列見表2。檢測的臨界點設(shè)定在PCR擴增過程中，熒光信號由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)(Ct)作為模板初始濃度的間接指標(biāo)，熔解曲線分析采用默認(rèn)條件。結(jié)果以18S rRNA進行校正，用ΔΔCt法計算相對基因表達量。

PCR: polymerase chain reaction;SphK1:sphingosine kinase 1；TNF-α: tumor necrosis factor-α.

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 預(yù)測可能調(diào)控SphK1 mRNA表達的microRNA

采用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫TargetScan和miRWalk對可能調(diào)控SphK1的microRNA進行預(yù)測。由TargetScan Human獲得143個miRNA，miRWalk獲得387個miRNA，兩者結(jié)果取交集，獲得34個miRNA(圖1)。由于后續(xù)工作中將在造模小鼠肝臟組織中檢測miRNA的表達情況，故在這些miRNA中選取人鼠同源的miRNA，結(jié)果為miR-378a-5p、miR-92a-2-5p和miR-708-5p。

2.2 參與肝臟纖維化microRNA的篩選

在造模小鼠肝臟組織樣本中檢測以上3種miRNA的表達狀況。與對照組miR-378a-5p的表達相比，CCl4組miR-378a-5p的表達下調(diào)至0.56倍(P<0.05)；與對照組miR-92a-2-5p的表達相比，CCl4組miR-378a-5p的表達下調(diào)至0.98倍(P<0.05)；與對照組miR-708-5p的表達相比，CCl4組miR-708-5p的表達上調(diào)至9.82倍(P<0.05)(圖2A)。

同時，在造模小鼠肝臟組織樣本中檢測炎性反應(yīng)及纖維化相關(guān)的指標(biāo)。與對照組相比，CCl4組小鼠肝臟中TNF-α mRNA的表達上調(diào)至6.30倍(P<0.05)(圖2B)，Col α1(Ⅲ) mRNA的表達上調(diào)至3.96倍(P<0.05)(圖2C)。此外，miR-378a-5p的表達與Col α1(Ⅲ)的表達呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.751(P<0.01)(圖2D)。根據(jù)miRNA負調(diào)控靶基因的先決條件,以及miR-378a-5p與Col α1(Ⅲ)的表達呈負相關(guān)，選取其作為后續(xù)研究對象，miR-92a-2-5p作為陰性對照。

圖1 生物信息學(xué)預(yù)測可能調(diào)控SphK1 mRNA的microRNAFig.1 Predict results for microRNA that may regulate SphK1 mRNA

2.3 miR-378a-5p和miR-92a-2-5p與SphK1 mRNA預(yù)測的結(jié)合位點

作為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，成熟的microRNA可以招募Ago蛋白，形成RISC復(fù)合體，通過與靶基因mRNA的3’UTR區(qū)域結(jié)合，抑制其翻譯或降解其mRNA，從而調(diào)控該基因的表達。由TargetScan數(shù)據(jù)庫得到，miR-378a-5p和miR-92a-2-5p與SphK1 mRNA 3’UTR的預(yù)測結(jié)合關(guān)系如圖3所示。

2.4 miR-378a-5p抑制LX-2中TGF-β介導(dǎo)的SphK1 mRNA表達上調(diào)

為了研究miR-378a-5p是否影響SphK1 mRNA的表達，對LX-2進行microRNA模擬物轉(zhuǎn)染的實驗。在轉(zhuǎn)染后第24小時換無血清培養(yǎng)基，加入TGF-β1(終濃度10 mg/L)，刺激24h后收集細胞，提取RNA進行反轉(zhuǎn)錄，后通過RT-qPCR檢測SphK1 mRNA的表達。結(jié)果表明，TGF-β1能夠明顯上調(diào)LX-2中SphK1 mRNA的表達，使其上調(diào)至3.99倍(P<0.05)。miR-378a-5p可以抑制這一過程(圖4)。

圖2 miR-378a-5p參與CCl4誘導(dǎo)的肝臟纖維化Fig.2 miR-378a-5p participated in CCl4-induced liver fibrosis

A：Relative miRNA expression was examined in the liver tissues of CCl4-treated mouses. miR-378a-5p, miR-92a-2-5p and miR-708-5p were detected, respectively;B：expression of TNF-α mRNA in the CCl4-treated mouse liver;C：expression of Colα1(Ⅲ) mRNA in the CCl4-treated mouse liver;D：correlation between miR-378a-5p expression and SphK1 mRNA expression;*P<0.05.CCl4：carbon tetrachloride；TNF-α：tumour necrosis factor-α；OO: olive oil;SphK1:sphingosine kinase 1.

圖3 miR-378a-5p/miR-92a-2-5p與SphK1 mRNA 3’UTR的預(yù)測結(jié)合位點Fig.3 Predicted binding sites between miR-378a-5p/miR-92a-2-5p and SphK1 mRNA 3’UTR

2.5 miR-378a-5p作用被抑制劑阻斷后LX-2中SphK1 mRNA表達上調(diào)

為了進一步研究miR-378a-5p調(diào)控SphK1 mRNA的表達，對LX-2進行miR-378a-5p抑制劑轉(zhuǎn)染的實驗。在轉(zhuǎn)染后第48小時收集細胞，提取RNA進行反轉(zhuǎn)錄，后通過RT-qPCR檢測SphK1 mRNA的表達。結(jié)果表明，采用miR-378a-5p抑制劑抑制miR-378a-5p的作用后，SphK1 mRNA的表達顯著上調(diào)，至對照組的2.16倍(P<0.05)(圖5)。

圖4 miR-378a-5p能夠抑制LX-2中由TGF-β1引起的SphK1 mRNA表達上調(diào)Fig.4 miR-378a-5p suppress the increase of SphK1 mRNA expression caused by TGF-β1 in LX-2

*P<0.05vsmimic Ctrl vehicle group，#P<0.05vsmimic Ctrl TGF-β1 group;SphK1:sphingosine kinase 1；TGF-β1:transforming growth factor-β1；Ctrl:control.

圖5 阻斷miR-378a-5p作用后SphK1 mRNA表達上調(diào)Fig.5 Increase of SphK1 mRNA expression caused by inhibition of miR-378a-5p in LX-2

*P<0.05;SphK1:sphingosine kinase 1.

3 討論

鞘胺醇激酶(sphingosine kinase, SphK)包括兩種亞型，SphK1和SphK2，均能催化鞘胺醇的磷酸化，產(chǎn)生脂質(zhì)分子 S1P。近幾年來，研究[23-25]結(jié)果表明SphK1參與了肝臟、心臟、肺臟等多種纖維化疾病的過程，并在其中發(fā)揮重要的作用。文獻[24]報道，TGF-β-SphK1 /S1P信號通路能夠促進腎小管上皮細胞的纖維化。也有研究[25]顯示，靶向SphK1可以緩解博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。通過以上證例可見詳盡探究SphK1參與纖維化過程分子機制的重要性，且相關(guān)研究可為纖維化疾病的治療提供新的思路。

有文獻[26]報道，SphK1能夠被多種因子激活，包括表皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍生生長因子、激素及TGF-β1。TGF-β1是重要的促纖維化細胞因子之一，在HSCs的活化和肝纖維化過程中發(fā)揮重要作用。研究[27-31]顯示，在肺臟、心臟及胚胎的成纖維細胞中，TGF-β1能夠增強SphK1 mRNA及蛋白的表達，促進纖維化的發(fā)生。本實驗室[9-11]前期結(jié)果也證實，TGF-β1誘導(dǎo)hMSCs及hHSCs分化為集成纖維細胞，并且上調(diào)hMSCs及hHSCs中SphK1的表達和活性。

近年來miRNA因參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控而備受關(guān)注，作為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，miRNA與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)，也為疾病的篩查和治療提供新的策略。miRNA是由內(nèi)源基因編碼的、長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。在細胞內(nèi)，miRNA與Dicer酶，AGO蛋白等生物大分子形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)并結(jié)合于靶標(biāo)mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslated regions, 3’-UTR)，主要通過促進mRNA降解、抑制翻譯的方式抑制靶基因表達[12]。

miR-378a為miR-378家族的一員，在CCl4肝纖維化模型中，miR-378a與另兩個家族成員miR-378b、miR-378d表達下降；且當(dāng)miR-378a過表達時，HSCs活化被抑制，肝纖維化程度減輕[32]。此外，miR-378還可以對心肌纖維化過程進行負調(diào)控[33]。而miR-92a則可以在肺纖維化過程中抑制TGF-β1誘導(dǎo)的WNT1誘導(dǎo)型信號通路蛋白1(WISP1)表達[34-35]。

本研究結(jié)果顯示，miR-378a-5p、miR-92a-2-5p和miR-708-5p與SphK1 mRNA 3’-UTR存在結(jié)合位點(生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測)。在造模小鼠肝臟組織樣本中，miR-378a-5p的表達明顯下調(diào)，miR-92a-2-5p的表達略微下調(diào)，miR-708-5p的表達顯著上調(diào)，根據(jù)miRNA負調(diào)控靶基因的先決條件，選取miR-378a-5p在LX-2細胞中進一步進行驗證。結(jié)果表明，miR-378a-5p能在LX-2細胞中調(diào)控SphK1 mRNA的表達。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測的結(jié)果，仍需要細胞實驗的進一步驗證。