陳曉曦，陳旭旭，林佳浩，陳吉彩，黃國裕

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 疝與腹壁外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學 第一臨床醫(yī)學院， 浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015）

Sirtuin（SIRT）家族（包括SIRT1-7）是一組NAD+依賴的去乙?；约癆DP-核糖基轉移酶家族，它們在能量代謝、基因組穩(wěn)定性、衰老以及壓力抵抗等方面起到重要作用[1]。SIRT7主要在細胞核表達，它能與組蛋白相互作用來調節(jié)核糖體基因轉錄[2]。 SIRT7被認為在轉錄過程中對連接染色體重建復合體與RNA Pol I中起到重要作用[3]。有研究發(fā)現(xiàn)SIRT7在小鼠模型和murine細胞系中有抑制腫瘤生長的作用[4]。但也有研究表明SIRT7能通過去乙?；鸵种颇[瘤抑制基因的轉錄來促進腫瘤的生長[5]。甲 狀腺癌中，目前有相矛盾的結果，DE NIGRIS等[6]發(fā)現(xiàn)SIRT7在甲狀腺癌細胞和組織中表達升高，不過ALJADA等[7]和CHEN等[8]卻發(fā)現(xiàn)SIRT7在甲狀腺癌中的mRNA表達水平低于癌旁非腫瘤性甲狀腺組織，并且，到目前為止，SIRT7在甲狀腺癌細胞中的作用未見報道。因此，本研究擬通過研究干擾SIRT7對甲狀腺癌細胞BCPAP體外增殖、遷移和侵襲能力的影響，以進一步明確SIRT7與甲狀腺癌的關系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 載體和病毒：干擾SIRT7的慢病毒由上海漢恒生物科技有限公司生產(chǎn)。載體為pHBLV-CMVIEZsGreen-T2A-Puro。干擾慢病毒（shSIRT7組）和陰性對照病毒（陰性對照組）的最終病毒滴度均為2× 108PFU/mL。

1.1.2 細胞系：人甲狀腺癌細胞系BCPAP購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.1.3 主要試劑：10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素、高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；反轉錄試劑盒（Prime-ScriptTMRT Master Mix，日本TaKaRa公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度試劑盒（上海碧云天公司）；兔抗人SIRT7多克隆抗體（1:1 000，ABV11620-50，蘇州百奇生物科技有限公司）；山羊抗兔二抗（ab97200，英國Abcam公司）；兔抗人GAPDH（1:1 000，ab8245，英國Abcam公司）；辣根過氧化物酶HRP-ECL（美國Millipore公司）；CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司）；Transwell板（美國Corning公司）；侵襲膠（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：將細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和青霉素/鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中。CO2培養(yǎng)箱設定的條件為37 ℃，5% CO2。干擾SIRT7的穩(wěn)定細胞株由慢病毒轉染并在2 μg/mL的嘌呤霉素中篩選2周。

1.2.2 RT-PCR：用反轉錄試劑盒將500 ng總RNA合成cDNA。將cDNA稀釋3倍后用RT-PCR試劑盒在RTPCR儀（美國BioRad公司）上合成。選用GAPDH為內參基因。各基因的引物為：SIRT7正向引物5’-AAAGGG AGAAGCGTTAGTGC-3’，反向引物5’-ACGCAGGAGGTACAG ACTTC-3’；GAPDH正向引物5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGC AGG-3’，反向引物5’-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’。PCR反應條件為：94 ℃ 2 min，然后94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行40個循環(huán)，最后72 ℃ 5 min后4 ℃維持。循環(huán)結束后，分析熔解曲線保證PCR產(chǎn)物的均一性。用2-ΔCt法對數(shù)據(jù)轉換后進行統(tǒng)計分析。

1.2.3 Western blot：細胞用RIPA裂解液在冰上裂解30 min，然后離心收集上清并用BCA蛋白濃度試劑盒測定濃度后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉到PVDF膜上。將膜置于10%脫脂牛奶中室溫封閉1 h后用一抗稀釋液稀釋的兔抗人SIRT7多克隆抗體在4 ℃冰箱孵育過夜。第2天用山羊抗兔二抗室溫孵育30 min。二抗孵育結束后，用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法進行顯色，在凝膠成像儀上拍攝[9]。內參抗體為兔抗人GAPDH。

1.2.4 細胞增殖活力檢測：參照CCK-8試劑盒操作說明進行檢測。實驗前1 d將處于對數(shù)生長期的細胞以1 000個/孔的密度接種在96孔板。檢測時向96孔板每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，然后將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱內孵育2 h后用酶標儀測定在450 nm 處測定吸光度。去掉每組5個復孔中的最大值和最小值，統(tǒng)計吸光度作為細胞增殖活力值。鋪板第2天檢測數(shù)值計為第1天。鋪板后隔1天換1次培養(yǎng)基。細胞增殖活力（%）=[A（加藥）-A（空白）]/ [A（未加藥）-A（空白）]×100%。A（加藥）：具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度；A（未加藥）：具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度。

1.2.5 劃痕實驗：干擾SIRT7的BCPAP細胞和陰性對照細胞以5×105每孔的密度接種在6孔板中并培養(yǎng)過夜。當細胞密度接近90%時，用移液器槍頭在孔底的細胞層上劃痕，然后用PBS緩沖液沖洗細胞3遍以移除脫落的細胞，剩余細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下拍照并測量細胞遷移距離。

1.2.6 細胞遷移和侵襲實驗：遷移實驗：將6×104個細胞混懸在0.2 mL無血清培養(yǎng)基中并鋪板在24孔Transwell板的上層小室中，下層小室加入0.6 mL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。細胞在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，然后用棉簽將小室上層的細胞擦除，將小室底部的細胞用甲醛固定后再用0.1%結晶紫染液染色，在顯微鏡下對小室底部的遷移細胞進行觀察拍照。侵襲實驗與遷移實驗步驟相似，但需要在細胞鋪板前在上層小室中加入侵襲膠。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意 義。

2 結果

2.1 構建干擾SIRT7的甲狀腺癌細胞BCPAP穩(wěn)定株 分別在mRNA和蛋白水平驗證SIRT7的干擾結果。shSIRT7組的mRNA水平較陰性對照組顯著下降（P＜0.01），shSIRT7組細胞的SIRT7蛋白表達量也較陰性對照組顯著降低（P＜0.01），見圖1。

2.2 干擾SIRT7對BCPAP細胞系的增殖、遷移和侵襲能力的影響 干擾SIRT7之后，BCPAP細胞的增殖能力顯著降低，劃痕愈合能力也下降，遷移和侵襲能力都受到了顯著抑制，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2-4。

圖1 干擾SIRT7后BCPAP細胞的SIRT7 mRNA和蛋白相對表達量

圖2 干擾SIRT7后BCPAP細胞的體外增殖活力變化

3 討論

研究顯示，多個SIRT家族成員在不同的腫瘤中扮演了不同的角色，這可能取決于具體的組織和腫瘤類型[10]。比如SIRT1在胃癌[11]、結腸癌[12]、前列腺癌[13]以及皮膚癌[14]等腫瘤中表達是升高的，這提示它在這些腫瘤中應該扮演了促進腫瘤形成的作用。但另外有一些研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在乳腺癌[15]中表達是降低的，并且，在小鼠APCmin/+模型中，SIRT1能抑制小鼠腸道腫瘤的形成[16]。與此相類似的還有SIRT2，它在乳腺癌[17]、膠質瘤[18]、皮膚癌[19]等腫瘤中表達降低，而在急性髓性白血病[20]及前列腺癌[21]中表達升高。因此，我們不能隨便把一種腫瘤中的研究結論外推到另一種腫瘤中去。

圖3 干擾SIRT7后BCPAP細胞的劃痕愈合能力變化

圖4 干擾SIRT7后BCPAP細胞的遷移和侵襲能力變化

目前發(fā)現(xiàn)SIRT7在大多數(shù)腫瘤中的表達是上調的。比如KIM等[22]發(fā)現(xiàn)SIRT7在人肝癌組織中表達上調并且敲減SIRT7能通過影響細胞周期和自噬相關蛋白來抑制肝癌細胞體外和體內生長。YU等[23]發(fā)現(xiàn)SIRT7在結腸癌中表達上調并且SIRT7能通過調節(jié)MAPK信號通路和EMT來影響結腸癌細胞的增殖和遷移。ASHRAF等[24]發(fā)現(xiàn)SIRT7在乳腺癌中表達上調，GENG等[25]發(fā)現(xiàn)SIRT7表達上調與乳腺癌的不良預后有關。此外，SIRT7還被發(fā)現(xiàn)在胃癌[26]和卵巢癌[27]細胞中表達上調。MCGLYNN等[28]等卻發(fā)現(xiàn)SIRT7在胰腺癌中表達降低，并且SIRT7表達高的胰腺癌患者有更長的術后生存時間。這些結果提示SIRT7可能同時具有癌基因和抑癌基因的作用。目前SIRT7在甲狀腺癌中的研究有不一致的結論，DE NIGRIS等[6]發(fā)現(xiàn)SIRT7在甲狀腺癌細胞和甲狀腺癌組織中表達升高，但是ALJADA等[7]在包含乳腺癌、結腸癌、肝癌、甲狀腺癌等多個腫瘤標本的cDNA芯片上研究了SIRT7的表達情況，發(fā)現(xiàn)SIRT7的mRNA表達水平在甲狀腺癌中是顯著下調的。我們之前的研究通過對包含43例甲狀腺癌和癌旁甲狀腺組織的組織芯片進行免疫組織化學實驗，發(fā)現(xiàn)SIRT7在甲狀腺癌中的蛋白水平低于癌旁非腫瘤甲狀腺組織[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)干擾SIRT7能顯著抑制BCPCP細胞的增殖、遷移和侵襲能力。這些結果表明SIRT7可能在甲狀腺癌中扮演了癌基因的角色，因此，SIRT7可能是甲狀腺癌一個潛在的治療靶點。