張煒， 黃林潔， 陳茗

1深圳市南山區(qū)西麗人民醫(yī)院呼吸內科(廣東深圳 518055)； 2中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院呼吸科(廣東廣州 510120)

哮喘發(fā)病的重要機制之一為氣道平滑肌的異常增殖導致的氣道重構，氣道重塑的主要病理基礎為氣道管壁增厚，其中又以氣道平滑肌細胞(ASMCs)增生，增殖最為重要，從而導致氣道管腔狹窄和氣道阻力增加[1-5]。轉化生長因子-β1(TGF-β1)作為一個重要的調節(jié)因子，在以往的研究中，顯示參與重癥哮喘纖維化的過程[6-7]。在體外實驗中表明TGF-β1還可以刺激平滑肌細胞的增殖和遷移[8-9]。miR-23b中已被報道參與許多細胞功能，包括細胞增殖，遷移和分化[10-14]。為了探討miR-23b對TGF-β1誘導的小鼠ASMCs增殖、凋亡的影響及機制的研究，于2016年10月至2017年10月間進行了該項研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 成年6～8周齡BALB/c小鼠(雌性)從中山大學實驗動物中心獲得，合格證號：廣東省實驗動物檢測證書號SCXK(粵)2011-0029。所有實驗均按照中山大學動物實驗的規(guī)定執(zhí)行。DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone公司；TGF-β1購自美國R&D 公司；CCK-8試劑購自碧云天公司；TRIzol、逆轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司；引物設計與合成由上海生工公司完成；蛋白提取試劑盒購自北京普利萊公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；Smad3抗體均購自美國Cell signaling technology公司；羊抗兔二抗購自Santa公司；其他試劑均系進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 ASMCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 采用組織塊貼壁法培養(yǎng)ASMCs。取6～8周BALB/c小鼠，將BALB/c小鼠處死后，分離出氣管及支氣管，置于含0.1%膠原酶的Hanks′平衡鹽溶液(HBSS)中。在解剖顯微鏡下將支氣管外膜剝離干凈，刮除內皮，將獲得的單層在小燒杯中剪成1 mm3的小塊后，置于含20%牛血清(FBS)，100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM基質中培養(yǎng)。待組織塊周圍細胞生長融合至80%后，采用α-肌動蛋白(α-actin)免疫細胞化學染色鑒定ASMCs。并對ASMCs對進行傳代，并選擇P4～6代ASMCs進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞轉染及TGF-β1刺激 根據實驗目的分為6組：(1)空白組(blank組)；(2)空脂質體組(empty lipoblast組)；(3)miR-23b mimic組；(4)mimic negative control組(mimic NC組)；(5)miR-23b inhibitor組；(6)inhibitor negative control組(inhibitor NC組)；轉染前1 d，接種1×105細胞至含有1 mL完全培養(yǎng)基的12孔板中，使轉染時的細胞融合度達到70%～80%。miR-23b mimic組、mimic NC組、miR-23b inhibitor組及inhibitor NC組細胞根據廠家說明書采用Lipofectamine 2000試劑對應轉染入mimics、mimic NC、inhibitor、 inhibitor NC細胞。blank組及empty lipoblast組細胞分別加入等體積的PBS溶液及empty lipoblast。各組細胞轉染24 h后采用TGF-β1(10 μg/L)處理。TGF-β1處理后進行以下實驗。

1.2.3 miR-23b靶點預測及雙熒光素酶活性分析 我們根據Sanger microRNA registry數據庫獲取小鼠miR-23b的序列信息。進一步通過生物信息學軟件TargetScan (www.targetscan.org) 和microrna.org (http://www.microrna.org)對miR-23b的靶基因進行預測，發(fā)現(xiàn)Smad3是miR-23b的一個靶基因。

為了驗證miR-23b對Smad3的表達抑制是直接作用還是間接通過其他信號通路調節(jié)，實驗采用雙熒光素酶報告實驗進行分析。構建miR-23b與Smad3的3′UTR結合位點突變的報告基因，構建目的報告質粒，將其轉染進AMSCs中，同時分別將miR-23b mimics、inhibitor及各自的載體轉染入AMSCs內，用雙熒光素酶報告實驗檢測靶基因的熒光強度。

1.2.4 CCK-8檢測細胞增殖 收集對數期細胞種96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液，各組依次加入對應的藥物。96孔板置于5% CO2、37℃孵育24、48、72 h。進而每孔加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h。用酶標儀在450 nm波長處測每孔的光密度值(OD)。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡的分析 用ddH2O將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer，每0.5 mL 1×Binding Buffer加入5 μL Annexin V和10 μL PI，配制成Annexin V/PI染色工作液。吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，每孔用2 mL PBS輕輕潤洗培養(yǎng)板內細胞，吸去PBS，每孔加入0.5 mL 0.25%胰酶，孵育，在顯微鏡下觀察，當胞質回縮，細胞之間不再連接成片，吸去胰酶，加入2 mL PBS，吹打，制成單細胞懸液，將其移至流式管，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入200 μL Annexin V/PI染色工作液，重懸細胞，輕輕吹打，避光孵育15 min，上機檢測。

1.2.6 RT-PCR檢測miR-23b、Smad3的表達 RNA提取和實時定量PCR：利用Trizol試劑提取組織總RNA(包括miRNA)。500 ng RNA用來進行反轉錄反應，在反轉錄酶的作用下利用miR-23b的特異性反轉錄引物合成cDNA。實時定量PCR反應按照2×SYBR Green Master Mix的說明要求進行，反應體系為：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2×SYBR Green Mix 10 μL，無菌蒸餾水7 μL。在Bio—Rad實時定量PCR儀上進行。反應條件是：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，進行40個循環(huán)。本實驗所用引物如表1所示，并以U6 RNA作為內參檢測組織中miR-23b、Smad3的表達水平。

表1 RT-PCR反應引物

1.2.7 Western blot檢測Smad3表達 用BSA法測蛋白濃度。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，轉移至硝酸纖維膜(PVDF膜)，加入兔抗鼠Smad3抗體浸泡濾膜，4℃過夜，洗滌后加入堿磷酶標記的羊抗兔IgG，洗膜后ECL化學發(fā)光試劑檢測。定量分析采用分子生物學圖像分析系統(tǒng)。

2 結果

2.1 ASMCs的鑒定 從BALB/c小鼠中分離培養(yǎng)的原代AMSCs具有典型的“峰谷”生長狀態(tài)(圖1-A)。AMSCs經α-actin免疫細胞化學染色后發(fā)現(xiàn)，大部分細胞α-actin染色陽性(圖1-B)。證明本實驗所分離培養(yǎng)的細胞為ASMCs。

2.2 轉染后miR-23b在各組ASMCs的表達 如圖2所示，轉染miR-23b mimics后，ASMCs miR-23b的表達顯著上升，較未轉染miR-23b mimics組為14 差異倍數(fold change)，而轉染miR-23b inhibitor后，ASMCs miR-23b的表達顯著下降，約是blank組的1/10差異倍數(fold change)。

A：倒置顯微鏡下ASMCs的形態(tài)(×100)；B：α-SMA免疫細胞化學染色(×100)

圖1 ASMCs的鑒定

A:擴增分析；B:miR-23b的表達量，miR-23b mimic 組及miR-23b inhibitor 組與其各自的對照組相比*P<0.01

2.3 miR-23b抑制TGF-β1誘導的氣道平滑肌細胞增殖 CCK-8結果顯示(圖3)，blank組OD值隨時間延長而明顯升高(P<0.05)。其中miR-23b mimic轉染到AMSCs后，miR-23b mimic組ASMC在48 h的OD值為0.49±0.03，顯著低于blank組的0.63±0.04、empty lipoblast組的0.63±0.03、mimic NC組的0.63±0.04、inhibitor NC組的0.64±0.04和miR-23b inhibitor組的0.81±0.07；而miR-23b mimic組ASMC在72 h的OD值為0.61±0.03，顯著低于blank組的0.89±0.05、empty lipoblast組的0.83±0.03、mimic NC組的0.85±0.04、inhibitor NC組的0.85±0.03和miR-23b inhibitor組的1.23±0.09(P<0.05)。

2.4 miR-23b促進TGF-β1誘導的ASMCs凋亡 如圖4所示，經不同處理后的ASMCs細胞其凋亡率如表2所示，其中miR-23b mimics組的早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡率均顯著高于blank組、empty lipoblast組、mimic NC組、inhibitor NC組和miR-23b inhibitor組(P<0.05)。而miR-23b inhibitor組的早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡率均顯著低于blank組、empty lipoblast組、mimic NC組、inhibitor NC組和miR-23b mimic組(P<0.05)。見表2。

miR-23b mimic組及miR-23b inhibitor 組與其各自的對照組相比*P<0.01

圖4 miR-23b促進ASMCs凋亡

組別早期凋亡率晚期凋亡率總凋亡率空白組12.6±0.5?#7.5±0.9?#20.2±1.6?#空脂質體組13.1±0.9?#6.3±1.1?#19.4±1.1?#miR-23b mimic組23.5±1.4#8.7±1.6#32.3±1.4#mimic NC組13.4±1.3?#5.8±0.9?#19.2±1.7?#miR-23b inhibitor組5.5±1.2?4.7±0.9?10.3±2.0?inhibitor NC組13.5±1.1?#5.2±0.7?#18.7±1.8?#

*與miR-23b mimic組比較P<0.05；#與miR-23b inhibitor組比較P<0.05

2.5 miR-23b的靶基因Smad3 AMSCs在轉染入Smad3 wt后，在miR-23b mimics作用下，其中miR-23b mimic組的熒光素酶活性為(2.5±0.4)%，blank組為(4.1±0.2)%、NC組為(4.2±0.05)%、inhibitor NC組為(4.5±0.1)%、miR-23b inhibitor組為(6.1±0.5)%，其中miR-23b mimic組的熒光素酶活性顯著低于blank組、mimic NC組、inhibitor NC組和miR-23b inhibitor組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而在AMSCs在轉染入Smad3 mutant后，miR-23b mimics和inhibitor作用熒光素酶活性約為(3.9±0.06)%和(4.3±0.2)%，與blank組(4.3±0.1)%相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5。

2.6 miR-23b抑制Smad3 mRNA的表達 如圖6所示：在TGF-β1刺激48 h后，blank組Smad3 mRNA明顯升高(P<0.05)。miR-23b mimic轉染到ASMCs后，miR-23b mimic組的Smad3 mRNA表達為0.56±0.02，blank組為0.98±0.11、inhibitor組為2.25±0.6，經統(tǒng)計分析，miR-23b mimic組的Smad3 mRNA表達顯著低于blank組(P<0.05)，而miR-23b inhibitor組Smad3 mRNA值顯著高于blank組(P<0.05)。

圖6 miR-23b對Smad3在AMSCs中mRNA表達的影響

2.7 miR-23b抑制Smad3蛋白的表達 如圖7所示，在TGF-β1刺激48 h后，blank組Smad3表達顯著。MiR-23b mimic轉染到ASMCs后，miR-23b mimic組的Smad3 蛋白表達為0.15±0.03，blank組為1.02±0.01、miR-23b inhibitor組為1.59±0.17，經統(tǒng)計分析，miR-23b mimic組的Smad3 蛋白表達顯著低于blank組(P<0.05)，而miR-23b inhibitor組Smad3 mRNA值顯著高于blank組(P<0.05)。

圖7 miR-23b對Smad3在AMSCs中蛋白表達的影響

3 討論

在防治哮喘氣道重塑方面，目前尚未找到有效的預防或逆轉氣道重塑的措施。現(xiàn)有的治療方案包括糖皮質激素、支氣管擴張劑、白三烯調節(jié)劑等仍不能滿足部分哮喘患者的治療需求，每年死于哮喘病的患者有25萬之多。因此，進一步研究哮喘氣道重塑的發(fā)病機制，闡明起關鍵作用的蛋白分子及其調控方式，為確立新的治療靶點，從而進一步達到有效防治哮喘的目的，具有重要的意義。

miR-23b是一個多功能微小RNA(miRNA)，參與調節(jié)多種信號通路。最近大量研究顯示其作用涉及免疫、增殖、分化、凋亡、細胞黏附等各個方面，而且關于其功能及作用機制的研究仍在不斷擴展[15]。意大利布雷西亞大學Salvi等[16]研究顯示，正常人類真皮成纖維細胞AB2細胞株中高水平表達miR-23b，而尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA)和肝細胞生長因子受體(c-met)存在生理性下調；當應用抗轉染技術干擾內源性miR-23b表達時，正常AB2細胞株中內源性uPA和c-met含量增加。另一方面，發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中u-PA在基因轉錄和蛋白翻譯水平上均為高表達，而miR-23b分子表達水平很低；當肝癌細胞株SKHep1C3轉染miR-23b后，盡管相應信使RNAs (mRNAs)含量穩(wěn)定，內源性u-PA和c-met均被下調。由于u-PA mRNA和c-met mRNA表達水平與肝細胞肝癌緊密相關，同時u-PA和c-met均在腫瘤細胞的增殖、遷移中發(fā)揮作用，研究者認為miR-23b可能通過轉錄后水平下調u-PA和c-met途徑來減少肝癌細胞遷移[16]。研究發(fā)現(xiàn)miR-23b在人的結直腸癌樣本中表達明顯下降，miR-23b通過靶向抑制FZD7、MAP3k1等多種信號分子，在包括腫瘤生長、遷移及血管生成等腫瘤遷移的多個過程中發(fā)揮了重要的負調控作用[17]。研究組通過分子、細胞生物學、小鼠疾病模型和臨床樣本分析等多種研究手段，通過高通量microRNA芯片篩選發(fā)現(xiàn)了miR-23b是自身免疫病患者和自身免疫病小鼠模型的炎癥病理組織中共同下調的microRNA[18]。為探討miR-23b對TGF-β1誘導的小鼠氣道平滑肌細胞增殖，凋亡的影響及機制的研究，本研究合成miR-23b的類似物和抑制劑，轉染入氣道平滑肌細胞，明確其對ASMCs的影響。結果顯示miR-23b的過表達顯著抑制TGF-β1誘導平滑肌細胞增殖，促進細胞凋亡。

為了進一步研究的miR-23b的具體作用，以確定的miR-23b的靶基因。miR-23b靶向Smad3蛋白是由TargetScan的組合(www.targetscan.org)和microrna.org(http://www.microrna.org)預測。此外，最近的研究已經表明的miR-23b中的調節(jié)TGF-β1通過靶向Smad蛋白(Smad3蛋白，Smad4和Smad5)信號擔當分子開關[19-20]。因此，我們推測的miR-23b可以在ASMCs的終止通過靶向Smad3的參與。本研究中，發(fā)現(xiàn)miR-23b直接調節(jié)Smad3在ASMCs的表達。本研究的數據表明，靶向Smad3蛋白是由其中的miR-23b中控制許多細胞內轉導途徑的活性的機制之一。這些研究結果表明的miR-23b中促進ASMCs的由激活TGF-β1信號傳導途徑的生長和遷移。

為確立miR-23b作為哮喘治療的新靶標提供更充分的科學依據，由于本研究僅在細胞水平探討了miR-23b對TGF-β1/Smad3信號通路在ASMCs增殖凋亡的影響，需進一步在動物體內加以驗證。綜上所述，本研究證實了miR-23b對TGF-β1/Smad3信號通路及ASMCs增殖凋亡的影響，從分子水平進一步探討支氣管哮喘氣道重塑的發(fā)病機制。