周紫云， 姚宇峰， 張新文， 楊龍雨， 陳 珺， 戴書穎， 史 荔， 嚴(yán)志凌

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南 昆明 650118； 2.昆明醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 云南 昆明 650500； 3.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 云南 昆明 650500； 4.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 婦科， 云南 昆明 650118)

宮頸癌是引起女性死亡的主要惡性腫瘤之一，發(fā)展中國家宮頸癌發(fā)病人數(shù)約占全球的80%，死亡率接近50%[1]。CD133是宮頸癌腫瘤干細(xì)胞表面的標(biāo)記分子[2]，可通過PI3K、FAK及Wnt/β-catenin等多種細(xì)胞信號通路調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、分化、遷移、凋亡和代謝[3-6]。研究發(fā)現(xiàn),CD133+宮頸癌干細(xì)胞顯示出高度的致瘤性、耐藥性及抗細(xì)胞凋亡等特征[7]，提示CD133分子可能在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。CD133基因中的多態(tài)性位點(diǎn)與多種人類疾病存在相關(guān)性[8-15]，因此本研究選取CD133基因3-UTR區(qū)域的兩個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(single nucleotide polymorphisms，SNPs)rs2240688和rs3130，研究其在云南漢族人群宮頸癌患者與健康對照人群中的分布差異，分析其與云南漢族人群宮頸癌的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

根據(jù)“知情同意”原則，選取2012年10月～2018年1月在昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院收治的428例宮頸癌患者作為病例組，排除術(shù)前接受放、化療等抗腫瘤治療的患者，排除患有其他惡性腫瘤、或是合并心血管疾病患者，排除合并糖尿病、肝炎、腎病等疾病及資料不全患者。選取同期在昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院參加體檢HPV陰性的正常健康女性455例作為對照組。

1.2 方法

1.2.1樣本基因組DNA提取 采集研究對象空腹靜脈血，提取外周血基因組DNA(QIAamp DNA Blood Mini Kit，貨號51106)，檢測濃度及純度(超微量紫外可見光光度計ND-2000，Thermo Fisher Scientific)后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2SNP位點(diǎn)的基因分型CD133基因中rs2240688和rs3130位點(diǎn)基因分型采用Taqman探針熒光定量PCR的方法進(jìn)行。用于CD133基因rs2240688和rs3130位點(diǎn)的基因分型的試劑盒分別為C_____89927_1_和C_____89925_20，分型使用的Master Mix試劑均購自美國ABI公司(Applied Biosystems)?；蚍中蚉CR反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，92 ℃變性15 s、60 ℃退火1 min(40個循環(huán))，40 ℃最后延伸5 min；以去離子水代替DNA模板作為基因分型的陰性對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件和Microsoft Excell軟件，病例組和對照組間年齡的差異采用Studentt檢驗(yàn)，兩組選取樣本的群體代表性采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)；采用在線軟件SHEsis分析CD133基因位點(diǎn)rs2240688及rs3130位點(diǎn)間的連鎖不平衡[8-9]，并根據(jù)連鎖不平衡結(jié)果構(gòu)建兩SNPs位點(diǎn)的單倍型；采用χ2檢驗(yàn)分析CD133基因rs2240688及rs3130等位基因、基因型及所構(gòu)建的單倍型的分布頻率在宮頸癌病例組和對照組中的差異，P<0.05表明不同組間的數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本信息及群體代表性

對照組共納入正常健康女性455例，平均(46.98±7.43)歲；病例組共納入428例，平均(46.25±9.59)歲，兩組受試者年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.179)。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，CD133基因rs2240688和rs3130位點(diǎn)各基因型在病例組(P=0.88、0.75)和對照組(P=0.99、0.37)的分布均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(P>0.05)，表明本研究所選取的樣本是具有群體代表性的隨機(jī)樣本。

2.2 CD133基因rs2240688及rs3130位點(diǎn)與與宮頸癌的相關(guān)性

病例組和對照組CD133基因rs2240688及rs3130位點(diǎn)的等位基因和基因型分布頻率見表1。結(jié)果顯示，rs2240688位點(diǎn)等位基因和基因型分布頻率在病例組和對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.019、0.040)，該位點(diǎn)等位基因G在病例組中的分布頻率顯著高于對照組，是云南漢族人群宮頸癌發(fā)生的風(fēng)險性因素(OR=1.292，95%CI為1.042～1.601)。而rs3130位點(diǎn)的等位基因和基因型分布頻率在宮頸癌病例組和對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示該位點(diǎn)與云南漢族人群宮頸癌發(fā)生風(fēng)險無相關(guān)性。

表1 兩組被檢者CD133基因rs22406882和rs3130位點(diǎn)等位基因及基因型頻率分布Tab.1 The distribution frequencies of alleles and genotypes of rs22406882 and rs3130 between case and control groups

2.3 rs22406882及rs3130位點(diǎn)的連鎖不平衡分析及單倍型構(gòu)建

結(jié)果顯示，CD133基因rs2240688及rs3130位點(diǎn)完全連鎖(D′=1.00)。構(gòu)建兩位點(diǎn)的單倍型，并分析分布頻率>3%的單倍型在病例組和對照組中分布頻率，結(jié)果顯示，病例組單倍型 rs2240688G-rs3130C的分布頻率顯著高于對照組(P=0.023)，提示單倍型rs2240688G-rs3130C是云南漢族宮頸癌發(fā)生的風(fēng)險性因素(OR=1.300，95%CI為1.037～1.630)，見表2。

表2 兩組被檢者CD133基因rs22406882及rs3130位點(diǎn)的單倍型頻率分布特征Tab.2 The distribution characteristic of haplotypes constructed by rs22406882 and rs3130 in CD133 gene

3 討論

CD133編碼基因位于人類染色體4p15上，被認(rèn)為是與癌癥易感性密切相關(guān)的區(qū)域[10-12]，其編碼蛋白CD133被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞的重要標(biāo)志分子[13-15]。研究發(fā)現(xiàn)CD133蛋白的表達(dá)與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等密切相關(guān)[3-5,16-17]?；虻?-UTR區(qū)域可能通過與microRNA的相互作用參與基因表達(dá)的調(diào)控[18-20]。已有研究發(fā)現(xiàn)，位于CD133基因3-UTR區(qū)域的SNPs位點(diǎn)與多種人類腫瘤具有相關(guān)性[21-23]。因此，本研究選取了位于CD133基因3-UTR區(qū)域的rs2240688和rs3130兩個SNPs位點(diǎn)，研究其與云南漢族人群宮頸癌發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性。結(jié)果顯示rs2240688位點(diǎn)等位基因和基因型在宮頸癌病例組和對照組的分布頻率比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果與Liu等[21]在肺癌以及Wang等[22]在胃癌中的研究結(jié)果相一致。有研究顯示rs2240688可能位于microRNA-135a/b的結(jié)合位點(diǎn)，而microRNA-135b在宮頸癌細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要調(diào)控作用[24]。因此，推測CD133基因rs2240688位點(diǎn)可能是通過影響靶向CD133 mRNA 3-UTR的microRNA-135b對CD133基因表達(dá)的調(diào)控，而在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。本研究進(jìn)一步分析了位于CD133基因3-UTR區(qū)域的rs2240688和rs3130位點(diǎn)間的連鎖關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩個位點(diǎn)存在強(qiáng)連鎖。而對構(gòu)建的單倍型與宮頸癌的相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，rs2240688G-rs3130C單倍型與宮頸癌患病風(fēng)險增加具有相關(guān)性。這也與等位基因分析結(jié)果中rs2240688等位基因G可能是宮頸癌的風(fēng)險因素的結(jié)果相符。

綜上，宮頸癌是僅次于乳腺癌的引起女性死亡的惡性腫瘤，近幾年宮頸癌在中國的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢[25]，宮頸癌的早期篩查對于降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡率具有重要的意義。因此，尋找特異性的宮頸癌診斷和治療靶標(biāo)對于宮頸癌的早期診斷治療非常重要。本研究發(fā)現(xiàn)位于宮頸癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志分子CD133基因3-UTR區(qū)域的SNP位點(diǎn)rs2240688與云南漢族宮頸癌的發(fā)生具有相關(guān)性，該位點(diǎn)等位基因G是云南漢人群宮頸癌發(fā)生的風(fēng)險因素，這為尋找宮頸癌診斷治療靶標(biāo)提供了基礎(chǔ)的研究數(shù)據(jù)，但因樣本量的關(guān)系，本研究的結(jié)果需大樣本研究來進(jìn)行驗(yàn)證。