梁露群， 任飛燕， 劉玲伶， 彭 偉， 張小歡， 毛彥穩(wěn)， 劉慧銘， 王圓圓**， 石明雋， 郭 兵

(1.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 病理生理學教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學 貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550025)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)作為糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者常見且嚴重的合并癥之一，目前發(fā)病機制不甚清楚，尚缺乏有效治療藥物。研究發(fā)現(xiàn)，SnoN(Ski-related novel protein)/Ski可通過與Smads蛋白相互作用，均為轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)/Smads信號通路的負性調(diào)控因子[1]。研究發(fā)現(xiàn)，Ski蛋白在人神經(jīng)母細胞瘤[2]、惡性黑色素瘤[3]和前列腺癌[4]等腫瘤細胞中均有較多的表達[5]，c-Ski在動脈粥樣硬化中具有抗動脈粥樣硬化作用[6]，在心臟纖維化發(fā)生發(fā)展中具有抗纖維化作用[7]。另有研究發(fā)現(xiàn)，Ski蛋白在單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(UUO)大鼠腎間質(zhì)纖維化模型中表達下調(diào)，經(jīng)藥物治療后表達無明顯改變[8]。雖有研究發(fā)現(xiàn)Ski的表達和作用與SnoN類似[9]，但是有關Ski的作用和機制仍不清楚，且Ski在DN發(fā)病過程中的作用，目前也鮮有報道。因此，本研究通過觀察Ski、TGF-β1、Collagen-Ⅲ、E-cadherin、ααcad、Smad3、p-Smad3(Ser423/425)在胰島素降糖治療后的糖尿病大鼠腎組織中的變化，探究Ski在DN發(fā)病過程中的作用及可能機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及動物

1.1.1主要試劑 辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG、兩步法免疫組織化學檢測試劑及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生技術有限公司，BCA(bicinchoninic acid)試劑盒及ECL顯色劑購自北京碧云天生物研究所，rabbit-anti-Collagen-Ⅲ、rabbit-anti-E-cadherin、rabbit-anti-TGF-β1及rabbit-anti-Ski均購自北京博奧森，rabbit-anti-p-Smad3(Ser423/425)及rabbit-anti-Smad3均購自美國Cell Signaling Technology；鏈尿佐菌素(STZ)(美國Sigma公司)，地特胰島素(丹麥諾和諾德公司)，蛋白Marker(北京天根公司)， mouse-anti-β-actin(普美生物)。

1.1.2動物 清潔級雄性SD大鼠24只，北京華阜康生物科技股份有限公司，批號SCXK(京)2009—0004，體質(zhì)量(180±20) g。

1.2 方法

1.2.1DM模型建立及分組 將24只SD大鼠隨機分為正常對照組(NC)、糖尿病組(DM)和胰島素治療組(INS)，每組8只。DM組及INS組大鼠采用尾靜脈注射55 mg/kg鏈脲佐菌素的方法復制DM模型，72 h后測量空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L為造模成功；INS組于造模成功4周后給予胰島素22 U/(kg·d)治療6周，以隨機血糖值低于10 mmol/L評定為治療有效。

1.2.2標本采集 所有大鼠于造模第10周，尾靜脈取血檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)水平，且用代謝籠收集24 h尿液、考馬斯亮藍法檢測尿蛋白水平、并計算24 h尿蛋白量(24 h urine protein,24 h UP)；禁食6～8 h后，乙醚麻醉，股動脈取血、4 ℃離心分離血清、-20 ℃保存，采用檢測血清葡萄糖(blood glucose,BG)；開腹并用240 mL生理鹽水灌洗后取雙側(cè)腎臟，一側(cè)腎臟用于觀察病理學改變及免疫組織化學染色；另一側(cè)腎臟在-80 ℃冰箱保存，用于提取組織蛋白。

1.2.3免疫組織化學染色 采用鏈霉菌素抗生物素蛋白─過氧化物酶連結(jié)(SP)二步法免疫檢測試劑盒檢測腎組織Ski、Collagen-Ⅲ、E-cadherin表達情況。脫蠟與水化后，修復抗原，3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，一抗孵育濃度分別為Ski(1∶25)、Collagen-Ⅲ(1∶150)、E-cadherin(1∶100)；HRP標記山羊抗小鼠IgG孵育E-cadherin，HRP標記山羊抗兔IgG孵育Ski 、Collagen-Ⅲ。DAB室溫顯色，蘇木素復染自然晾干后用中性樹膠封片，光鏡下觀察并采集圖片。特異性陽性染色評價標準：在蛋白表達部位出現(xiàn)黃棕色顆粒即為陽性結(jié)果。結(jié)果記數(shù)：采用定量圖像分析系統(tǒng)(Image-Pro V6.0)在高倍(400×)鏡下每張切片隨機取10個視野確定陽性染色的區(qū)域，動脈被排除在研究之外，計算陽性染色的面積占總面積的比例。

1.2.4Western blot檢測目的蛋白表達 取100 mg保存于-80 ℃冰箱的大鼠腎組織，于冰上用蛋白裂解液加5×PBS充分勻漿研磨處理；6 000 r/min、4 ℃離心15 min、取上清液， BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度；上樣后聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫下用5%脫脂牛奶液孵育1 h。一抗孵育濃度分別為Ski(1∶200)、TGF-β1(1∶300)、Collagen-Ⅲ(1∶1 000)、α-SMA(1∶300)、Smad3(1∶150)、p-Smad3(Ser423/425) (1∶150)4 ℃冰箱中孵育14～16 h后，用1%脫脂牛奶液稀釋二抗(1∶5 000～1∶7 000)，在室溫下?lián)u床(慢速)孵育1～2 h。用ECL顯色液顯色，Bio-RAD成像系統(tǒng)分析目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 DM相關指標

與NC組大鼠比較， DM組大鼠出現(xiàn)多尿、多飲、多食的DM癥狀，并伴有體質(zhì)量減輕、血糖升高和HbA1c增高；INS組大鼠經(jīng)控制血糖治療后，糖尿病典型癥狀明顯改善，體質(zhì)量增加、血糖下降和HbA1c降低。見表1。

表1 各組大鼠DM相關指標比較Tab.1 Comparison of biochemical indicators in each group

(1)與NC 組比較，P<0.05；(2)與DM組比較，P<0.05

2.2 腎組織學觀察

NC組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)和紋理清晰，腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cell，RTEC)排列整齊，飽滿，腎小球清晰可見。而DM組大鼠腎組織中可見部分腎小管管腔擴張，RTEC發(fā)生空泡樣變性，細胞萎縮、脫落，腎小管和腎小球纖維化病變明顯。與DM組大鼠比較，INS組大鼠腎組織可見空泡樣變性細胞明顯減少，腎小球和腎小管纖維化病變情況改善，見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)觀察(HE，×200)Fig.1 Pathological observation of renal tissue in each group

2.3 腎組織Ski、Collagen-Ⅲ和E-cadherin的分布及表達

如圖2，腎組織中Ski蛋白主要分布于細胞核內(nèi)，胞質(zhì)中有少量表達；NC組Ski表達較少，DM組中Ski表達明顯增多，而在INS組中Ski表達較DM組有所減少。NC組腎組織中Collagen-Ⅲ陽性染色主要可見于腎小管間質(zhì)、呈線性分布，而E-cadherin分布于腎小管上皮細胞；Collagen-Ⅲ在DM組中的表達較NC組明顯增多，而在INS組中的表達較DM組有所減少(P<0.05)；相反，E-cadherin在DM組中表達較NC組減少，而INS組中表達較DM有所恢復(P<0.05)。

(1) 與NC 組比較，P<0.05；(2) 與DM組比較， P<0.05圖2 Collagen-Ⅲ和E-cadherin在各組大鼠腎組織中的分布及表達(DAB,×400)Fig.2 Immunohistochemical results of collagen-Ⅲ and E-cadherin in renal tissues of each group

2.4 腎組織Ski、TGF-β1、Collagen-Ⅲ、α-SMA和p-Smad3(Ser 423/425)蛋白表達水平

與NC組大鼠比較，DM組大鼠腎組織Ski、TGF-β1、Collagen-Ⅲ、α-SMA和p-Smad3(Ser432/425)蛋白表達顯著增加(P<0.05)；而與DM組大鼠比較，INS組大鼠腎組織Ski、TGF-β1、Collagen-Ⅲ、α-SMA和p-Smad3(Ser432/425)蛋白表達顯著減少(P<0.05)，各組Smad3蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3 。

3 討論

DN是DM患者常見的微血管并發(fā)癥，主要病理表現(xiàn)為腎臟肥大，伴有持續(xù)性尿蛋白增多及進行性腎功能衰竭等[10]。本研究通過尾靜脈注射鏈尿佐菌素復制1型糖尿病大鼠模型，注射72 h后，SD大鼠血葡萄糖≥16.7 mmol/L，并且出現(xiàn)體質(zhì)量明顯減輕和多食、多尿、多飲的癥狀，提示DM動物模型復制成功。免疫組織化學染色觀察到腎組織中Collagen-Ⅲ表達增加而E-cadherin表達減少；Western blot結(jié)果顯示腎組織中Collagen-Ⅲ和α-SMA表達上調(diào)，而E-cadherin表達下調(diào)，且病理學切片結(jié)果提示早期DN樣改變，說明已發(fā)生DN。

(1) 與NC 組比較，P<0.05；(2) 與DM組比較， P<0.05圖3 各組大鼠腎組織中Ski、TGF-β1、Collagen-Ⅲ、α-SMA和p-Smad3(Ser 423/425)蛋白表達水平(Western blot)Fig.3 Ski, TGF-β1, Collagen-Ⅲ、α-SMA, and p-Smad3(Ser 423/425) protein expression levels in kidney tissue of rats in each group

許多有關腎纖維化的研究結(jié)果均提示，TGF-β1在多種腎組織細胞中高表達，發(fā)揮致纖維化效應[11]。TGF-β1主要通過活化Ⅰ型(TβRⅠ)和Ⅱ型(TβRⅡ)跨膜受體，磷酸化活化其下游的Smad2/3，隨后Smad2/3與Smad4形成復合體轉(zhuǎn)移到細胞核中，調(diào)節(jié)TGF-β1目的基因的轉(zhuǎn)錄活化，從而發(fā)揮其致纖維化效應[12]。Western blot結(jié)果顯示，DM 造模10周時，大鼠腎臟組織中TGF-β1和p-Smad3(Ser432/425)表達量明顯增多，而Smad3蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，提示DN時TGF-β1/ Smads信號通路被激活。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，c-Ski在動脈粥樣硬化中具有抗動脈粥樣硬化作用[13]，在心臟纖維化發(fā)生發(fā)展中具有抗纖維化作用[14-15]；Ski在神經(jīng)系統(tǒng)形成和發(fā)育中有重要作用[16]；而在胰腺癌、神經(jīng)母細胞癌、惡性黑色素瘤、前列腺癌和脊髓損傷中，Ski均有較高表達[17]。目前研究發(fā)現(xiàn)Ski / SnoN可以抑制TGF-β1信號通路，而TGF-β1對Ski / SnoN具有負反饋調(diào)節(jié)作用，Ski / SnoN均可被激活的TGF-β1所降解[18]。然而有研究發(fā)現(xiàn)，SkimRNA水平不受TGF-β1的影響，Ski蛋白相較SnoN而言更穩(wěn)定，不易降解[19-20]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)腎間質(zhì)纖維化模型中，TGF-β1大量增多和活化后，才可導致Ski蛋白的降解[21]。提示，Ski與SnoN雖同為Ski家族成員，但在各組織、各器官及各種病變中的表達和作用各不相同。本研究結(jié)果顯示，在高血糖作為致病因子的作用下，可導致腎組織TGF-β1/Smad3信號通路隨病程進展而活化；同時，高糖可能通過多種機制上調(diào)Ski的表達，發(fā)揮抑制TGF-β1/Smad3通路致纖維化效應的作用，但由于逐漸增多的TGF-β1所介導的Ski蛋白降解尚未完全起效，且TGF-β1/Smad3信號通路的活化超過了Ski對其的抑制作用，最終表現(xiàn)出TGF-β1/Smad3信號通路過度活化，致纖維化因素和抗纖維化的平衡被打破，纖維化病變明顯。

本實驗于DM成模4周后開始胰島素降糖治療，觀察控制血糖是否能延緩DN的發(fā)生發(fā)展且是否對Ski的表達有影響。實驗結(jié)果顯示，與DM組相比，INS組大鼠多飲、多食、多尿現(xiàn)象有比較明顯的改善，伴有體質(zhì)量增加，24 hUP降低，HbA1c恢復。E-cadherin的表達恢復，而α-SMA表達減少，同時Collagen-Ⅲ在腎臟間質(zhì)的表達減少，且TGF-β1和p-Smad3(Ser432/425)表達較DM組大鼠均顯著下調(diào)。此外，免疫組化和Western blot結(jié)果均顯示大鼠腎組織中Ski蛋白的表達下調(diào)，提示控制血糖可下調(diào)Ski蛋白的表達，減弱TGF-β1/ Smad3信號轉(zhuǎn)導，使致纖維化和抗纖維化因素重新恢復平衡，延緩纖維化進程。

綜上所述，DN中Ski蛋白表達代償性增加，TGF-β1/Smad3信號通路過度激活，加重纖維化；而控制血糖可以下調(diào)Ski蛋白的表達水平，阻止腎組織中TGF-β1/ Smad3信號通路的過度激活，減少ECM合成，延緩DN的進展。然而，Ski蛋白在DN中的具體作用機制還有待進一步的研究證實。