李婷婷，李 鑫，2，王 婷，李 萌，馬玉萍，童延斌，劉明亮

（1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000；2.新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，新疆石河子 832000；3.石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆石河子 832000）

甘草是傳統(tǒng)中藥材之一，有“眾藥之王”“十方九草”美譽(yù)之稱（羅燕燕等，2017）。甘草渣是在提取甘草浸膏、甘草酸等產(chǎn)品后的殘?jiān)?，目前在新疆地區(qū)尚未得到合理的開發(fā)利用（Luo 等，2017）。研究表明，甘草廢渣里含有多糖、黃酮類、生物堿、甘草酸、氨基酸、甾體、三萜類、有機(jī)酸、香豆素、萜類內(nèi)酯等化合物（袁茹楠，2017），以及Sr、Fe、Zn、Mn 等無機(jī)成分，這些營養(yǎng)物質(zhì)具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗?jié)兒涂寡趸茸饔茫╔ie 等，2017），故甘草渣也被視為寶貴的可再利用植物資源（Kooravand 等，2017）。若能將其轉(zhuǎn)化為動(dòng)物飼料，對(duì)牲畜生產(chǎn)性能、體質(zhì)和增強(qiáng)免疫力具有很好的促進(jìn)效果。當(dāng)前，許多畜牧業(yè)發(fā)展較快的國家和地區(qū)都對(duì)抗生素類飼料添加劑進(jìn)行了嚴(yán)格監(jiān)管。我國相關(guān)食品監(jiān)管部門也開始重視畜禽養(yǎng)殖使用的抗生素，并不斷探索尋求更加安全、環(huán)保的飼料添加劑，以此來為畜產(chǎn)品提供安全保障。與抗生素飼料添加劑相比，天然植物所富含的營養(yǎng)成分副作用少，能提高動(dòng)物飼料的品質(zhì)，從而有效提高養(yǎng)殖效益。將甘草渣轉(zhuǎn)化為動(dòng)物飼料，不僅能降低環(huán)境污染和資源浪費(fèi)，更重要的是能提升動(dòng)物飼料品質(zhì)，提高動(dòng)物飼料的安全性，為畜牧產(chǎn)業(yè)帶來諸多好處（李麗萍，2016）。

甘草渣中木質(zhì)素和綜纖維素含量較高，其中綜纖維素包括纖維素和半纖維素（黃安民等，2007）。動(dòng)物本身對(duì)木質(zhì)素和綜纖維素幾乎不能消化吸收（Sharma 等，2010），只是依賴于其消化道內(nèi)的微生物來實(shí)現(xiàn)降解，若木質(zhì)素和綜纖維素在飼糧中占有較高比例，會(huì)對(duì)干物質(zhì)采食量產(chǎn)生負(fù)面影響（Yang，2012），導(dǎo)致動(dòng)物熱增耗增加和飼料利用率下降（張崇玉等，2014）。研究表明：飼糧粗纖維每提高1%，能量消化率下降1.13%，代謝能（ME）利用率下降0.19%，飼料轉(zhuǎn)化率下降3%（Kohlstedt 等，2018）。因此，甘草渣中存在大量難以降解的木質(zhì)素和綜纖維素嚴(yán)重阻礙了其飼料轉(zhuǎn)化。

目前針對(duì)動(dòng)物飼料中木質(zhì)素和綜纖維素的降解方法主要有復(fù)合酶處理法（李曉等，2016）、化學(xué)法（張素文，2016）和微生物處理法（孟婧，2016）三大類。復(fù)合酶處理法具有高效、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，適用于甘草渣的工業(yè)化處理，且相關(guān)研究未見報(bào)道。試驗(yàn)以新疆地產(chǎn)甘草渣為原料，采用復(fù)合酶處理法，在多糖和黃酮含量沒有明顯減少的前提下，以木質(zhì)素和綜纖維素的降解率為衡量指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)對(duì)甘草渣中的木質(zhì)素和纖維素的降解工藝進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、儀器和試劑 烏拉爾甘草渣由新疆阿拉爾新農(nóng)甘草公司提供。

復(fù)合酶（由含 22000 VISCO 單位/g 木聚糖酶和2 000 AGL 單位/g β-葡聚糖酶、纖維素酶、果膠酶等19 種酶組合在一起的復(fù)合酶制劑），購于北京安瑞博特生物技術(shù)有限公司。

無水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鈉、苯酚、濃硫酸、濃鹽酸均為市售分析純。

恒溫箱（DC-1006，上海平軒科學(xué)儀器有限公司制造）；分光光度計(jì)（滬制01030007 號(hào)，上海棱光技術(shù)有限公司制造）；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，TDL-5-A）；高壓滅菌鍋（LDZX-50FBS，上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 木質(zhì)素、綜纖維素、多糖和黃酮含量測(cè)定 根據(jù)李華等（2007）的方法測(cè)定甘草渣中木質(zhì)素、綜纖維素的含量，利用硝酸鋁法測(cè)定黃酮含量。利用苯酚- 硫酸法（Jun 等，2016）測(cè)定多糖含量。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析方法 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 15.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均設(shè)置了3 組重復(fù)，對(duì)方差進(jìn)行Duncan’s 法多重比較，P ＜0.05 表示差異顯著。

1.2.3 不同單因素對(duì)甘草渣中木質(zhì)素和綜纖維素效率的影響 精密稱取10 g 滅菌后的甘草渣樣品，置于玻璃培養(yǎng)瓶中，在121℃下滅菌20 min。依次進(jìn)行pH、酶解溫度、酶解時(shí)間、復(fù)合酶用量的單因素試驗(yàn)，其中每個(gè)因素包含6 個(gè)試驗(yàn)水平（見表1 ～4）并設(shè)置3 次平行試驗(yàn)。試驗(yàn)方法：取一定量復(fù)合酶溶解于不同pH 的1 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，于超凈工作臺(tái)中按照酶用量向甘草渣加入對(duì)應(yīng)體積的酶液，將培養(yǎng)瓶密封后置于不同溫度下的恒溫箱中進(jìn)行處理。達(dá)到反應(yīng)時(shí)間后迅速將酶液與樣品分離，按照1.2.1 中的方法分別檢測(cè)木質(zhì)素、綜纖維素的含量。對(duì)照組將酶液換成等體積的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液，其他因素與試驗(yàn)組相同。單因素試驗(yàn)結(jié)束后，按以下公式計(jì)算各組樣品中的木質(zhì)素、綜纖維素降解率

木質(zhì)素（纖維素或半纖維素）降解率/%=[（對(duì)照組總質(zhì)量- 試驗(yàn)組總質(zhì)量）/ 對(duì)照組總質(zhì)量]×100。

在查閱相關(guān)文獻(xiàn)和本試驗(yàn)所用復(fù)合酶的說明書后，推算復(fù)合酶用量90 mg/g，pH 為5.0，酶解溫度為40℃，酶解時(shí)間為18 h 可能為反應(yīng)的適宜條件，故將其設(shè)置為恒定因素。

表1 單因素試驗(yàn)指標(biāo) - 復(fù)合酶用量

表2 單因素試驗(yàn)指標(biāo)-pH

表3 單因素試驗(yàn)指標(biāo)- 酶解溫度

表4 單因素試驗(yàn)指標(biāo) - 處理時(shí)間

1.2.4 多因素正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以木質(zhì)素和綜纖維素降解率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照L9（34）表頭設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，每組設(shè)置3 個(gè)平行樣品。經(jīng)處理后的甘草渣，以1.2.1 的試驗(yàn)方法測(cè)定木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的降解率，并計(jì)算多糖和黃酮的增量水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同pH 對(duì)木質(zhì)素、綜纖維素降解率的影響 從表5 中可以看出，隨著pH 的升高，木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的降解率均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，在pH=6.5 時(shí)，木質(zhì)素的降解率為19.907%，相較于pH=6 時(shí)的降解率稍有下降。

表5 不同pH 對(duì)木質(zhì)素、綜纖維素降解率的影響

2.1.2 不同酶解溫度對(duì)木質(zhì)素、綜纖維素降解率的影響 從表6 中可以看出，木質(zhì)素、纖維素及半纖維素的降解率隨溫度升高呈先增大后減小的趨勢(shì)，在45℃時(shí)，木質(zhì)素降解率達(dá)到最大值19.997%，在50℃時(shí)，纖維素及半纖維素均達(dá)到最大降解率，分別為45.273% 和63.924%。

表 6 不同酶解溫度對(duì)木質(zhì)素、綜纖維素降解率的影響

2.1.3 不同酶解時(shí)間對(duì)木質(zhì)素、綜纖維素降解率的影響 從表7 可以看出，木質(zhì)素、纖維素及半纖維素的降解率均隨處理時(shí)間的增加而升高，在22 h 時(shí)降解率均達(dá)到最大值，分別為20.411%、45.718%、64.198%。

表7 不同酶解時(shí)間對(duì)木質(zhì)素、綜纖維素降解率的影響

2.1.4 不同復(fù)合酶用量對(duì)木質(zhì)素、綜纖維素降解率的影響 從表8 可以看出，隨著復(fù)合酶用量的增加，木質(zhì)素、纖維素及半纖維素的降解率也隨之增大，在復(fù)合酶用量為130 mg/g 時(shí)達(dá)到最大，分別為20.353%、46.600%、64.492%。

表8 不同復(fù)合酶用量對(duì)木質(zhì)素、綜纖維素降解率的影響

2.2 正交試驗(yàn) 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置3 組不同水平的pH、處理時(shí)間、酶解溫度、酶用量進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表9。

表9 正交試驗(yàn)結(jié)果

從表9 可以看出，在pH 為6.0，酶解溫度為45 ℃，酶解時(shí)間為16 h，復(fù)合酶用量為110 mg/g 的條件下，木質(zhì)素降解率可達(dá)20.340%，纖維素降解率可達(dá)46.303%，半纖維素降解率可達(dá)65.011%。此條件下木質(zhì)素及綜纖維素降解率均為最高值，故可選擇該條件作為最優(yōu)降解條件。

2.3 黃酮與多糖含量的變化 從表10 中可以看出，經(jīng)過復(fù)合酶處理后的甘草渣中黃酮和多糖的含量顯著增加，其中黃酮增加了219.62%，多糖增加了1780.51%。

表10 黃酮與多糖含量的變化

3 討論

從表中利用正交極差法得出的R 值可以看出，各試驗(yàn)因素對(duì)木質(zhì)素降解率的影響表現(xiàn)為：pH ＞處理時(shí)間＞復(fù)合酶用量＞酶解溫度；各試驗(yàn)因素對(duì)纖維素降解率的影響表現(xiàn)為：pH ＞處理時(shí)間＞復(fù)合酶用量＞酶解溫度；各試驗(yàn)因素對(duì)半纖維素降解率的影響表現(xiàn)為：pH ＞酶解溫度＞處理時(shí)間＞復(fù)合酶用量。結(jié)果顯示，pH 對(duì)復(fù)合酶降解甘草渣中木質(zhì)素及綜纖維素影響顯著，是主要影響因素，其次為處理時(shí)間。

黃愛玲（2005）研究表明，pH 高低不僅可以影響酶活力，并且可以在一定程度上影響酶的穩(wěn)定性，當(dāng)pH 超過一定的范圍會(huì)導(dǎo)致酶的不可逆變性。同時(shí)，pH 過高或過低會(huì)改變酶解離狀態(tài)，影響酶與底物的結(jié)合。因此，使用復(fù)合酶處理法降解甘草渣，控制pH 尤其重要。甘草渣中木質(zhì)素及綜纖維素含量較高，木質(zhì)素作為外衣保護(hù)著纖維素和半纖維素免受酶的降解（張璐，2016）。故酶解效果受到酶解時(shí)間的限制，處理時(shí)間越長，酶解效果越好。但考慮到生產(chǎn)時(shí)的成本問題，選擇酶解16 h 作為最佳處理時(shí)間，既能使木質(zhì)素及綜纖維素得到有效降解，還能降低生產(chǎn)成本。

在已知報(bào)道中，復(fù)合酶處理法主要采用漆酶、纖維素酶、果膠酶等，通過一定比例混合后在常溫下對(duì)植物材料進(jìn)行處理，以高效降解其中木質(zhì)素、纖維素和半纖維素，常見于秸稈和農(nóng)副產(chǎn)品的飼料初加工過程（張強(qiáng)等，2009）。本試驗(yàn)中木質(zhì)素的降解率與王健等（2017）以毛竹為試驗(yàn)材料，采用纖維素酶解法得到降解率基本相同，其最佳反應(yīng)條件為：酶解反應(yīng)時(shí)，控制酶/ 底物比1 ∶8，底物濃度為0.025 g/mL，反應(yīng)溫度50℃下反應(yīng)48 h?？梢钥闯?，采用復(fù)合酶法降解木質(zhì)素及綜纖維素效率更高。纖維素的降解率與劉朝龍等（2012）利用纖維素酶對(duì)花生殼進(jìn)行酶解的降解率相比較低，其測(cè)得最佳酶解條件下纖維素降解率為63.61%，可能是因?yàn)樵囼?yàn)材料和使用酶的不同導(dǎo)致了一定的差異。

由此可知，用復(fù)合酶降解甘草渣中的木質(zhì)素及綜纖維素效率較高。用復(fù)合酶處理甘草渣可以使甘草渣中的有效成分被釋放出來，纖維素酶還可以將纖維素降解為單糖，有利于動(dòng)物吸收。

4 結(jié)論

本研究通過單因素和正交試驗(yàn)篩選出適用于復(fù)合酶降解甘草渣中木質(zhì)素及綜纖維素的最佳工藝條件為復(fù)合酶用量110 mg/g，pH 6.0，酶解溫度45℃，酶解時(shí)間16 h。在此條件下，木質(zhì)素降解率可達(dá)20.340%，纖維素降解率可達(dá)46.303%，半纖維素降解率可達(dá)65.011%。同時(shí)，處理后的甘草渣中黃酮和多糖的含量顯著增加，黃酮含量增加了219.62%，多糖含量增加了1780.51%。研究為甘草渣飼料化提供了理論依據(jù)。