李 蓓 薛天琳 崔 華 鞏文玉 劉曙光 李 君 高 超

白血病是兒童期最常見(jiàn)的惡性疾病，其中約80%為急性淋巴細(xì)胞白血病 (ALL)。骨髓中原始淋巴細(xì)胞形態(tài)通常表現(xiàn)為細(xì)胞大小不等，形態(tài)較規(guī)則，胞漿少，呈藍(lán)色，核染色質(zhì)細(xì)膩，核仁不清晰。骨髓涂片檢查是診斷ALL最基本和便捷的方法。此外，ALL不同分型的原始淋巴細(xì)胞其細(xì)胞核的粗細(xì)程度、細(xì)胞漿的多少、空泡和核仁的有無(wú)等均有不同，且常可提示患者的預(yù)后[1]。近年來(lái)，分子遺傳學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于兒童ALL的診斷分型，并且可作為預(yù)后判斷的標(biāo)準(zhǔn)[2]。其中，混合譜系白血病(MLL)基因重排可見(jiàn)于2%～6%的兒童ALL[3]，且是劃分高危ALL的標(biāo)準(zhǔn)之一[4,5]。臨床形態(tài)學(xué)診斷工作中，發(fā)現(xiàn)MLL基因重排陽(yáng)性ALL患兒除了具有WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)中描述的原始和幼稚淋巴細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)，如細(xì)胞大小不一、胞漿量少、偶有空泡、核染色質(zhì)濃聚、核仁不清楚或可見(jiàn)之外, 還同時(shí)具有急性髓細(xì)胞白血病(AML)中原始粒細(xì)胞和原始單核細(xì)胞所具有的某些特點(diǎn)，如胞漿中可見(jiàn)嗜天青顆?；蛘呔哂袀巫悖渌?lèi)型ALL的惡性原始淋巴細(xì)胞卻少有這些特征。本文旨在研究MLL基因重排ALL患兒骨髓細(xì)胞形態(tài)的特點(diǎn)，并探討其與臨床特征和預(yù)后的相關(guān)性。

1 方法

1.1 研究方案 病例對(duì)照研究?；仡櫺允占锥坚t(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院(我院)治療的MLL基因重排ALL病例(MLL+組)，配對(duì)納入同期收治的非MLL基因重排的ALL患兒(MLL-)。MLL+組依據(jù)骨髓細(xì)胞中是否具有嗜天青顆粒、核仁、空泡和偽足，再分為形態(tài)學(xué)陽(yáng)性和陰性亞組。考察MLL+組和MLL-組形態(tài)特征差異；比較MLL+形態(tài)學(xué)陽(yáng)性和陰性亞組臨床表現(xiàn)和無(wú)事件生存率(EFS)，通過(guò)受試者工作曲線(ROC)探討骨髓細(xì)胞不典型形態(tài)特征對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)能力。

1.2 知情同意 本研究行骨髓細(xì)胞形態(tài)、組織化學(xué)檢查、MLL基因重排檢測(cè)和患兒資料收集均取得患兒監(jiān)護(hù)人的知情同意。中國(guó)兒童白血病治療協(xié)作組(CCLG)ALL-2008研究方案獲得我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3MLL+組納入標(biāo)準(zhǔn) 2011年1月1日至2018年5月31日我院血液腫瘤中心采用CCLG ALL-2008方案收治的MLL基因重排陽(yáng)性的ALL初診患兒。

1.4MLL-配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)MLL+組每例患兒收治時(shí)間前后1個(gè)月內(nèi)、同樣采用CCLG ALL-2008方案治療、性別相同、發(fā)病年齡差距最小的MLL-初診ALL患兒，如同一時(shí)間段符合條件的MLL-患兒不止1例，同時(shí)納入MLL-組。

1.5 骨髓細(xì)胞的染色、檢測(cè)和診斷標(biāo)準(zhǔn) 瑞氏染液、組織化學(xué)染色均采用珠海貝索生物技術(shù)有限公司所生產(chǎn)的試劑盒。組織化學(xué)染色包括過(guò)氧化物酶(POX)染色、糖原(PAS)染色、氯醋酸AS-D萘酚酯酶染色和非特異性醋酸AS-D萘酚酯酶染色+氟化鈉抑制實(shí)驗(yàn)?；純汗撬柰科瑯?biāo)本經(jīng)瑞氏染色或組織化學(xué)染色，顯微鏡鏡檢200個(gè)細(xì)胞。骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)根據(jù)WHO前體B和T細(xì)胞腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)[6]分類(lèi)和計(jì)數(shù)，細(xì)胞形態(tài)多表現(xiàn)為核染色質(zhì)濃聚，核仁不清楚，但其中大細(xì)胞的胞漿偶有空泡，核染色質(zhì)彌散或者細(xì)密，可見(jiàn)清晰的核仁。組織化學(xué)染色的賦分原則：POX染色陽(yáng)性反應(yīng)為胞漿含有藍(lán)色或藍(lán)棕色顆粒；氯醋酸AS-D萘酚酯酶染色陽(yáng)性反應(yīng)為胞漿含有紅色顆粒；非特異性醋酸AS-D萘酚酯酶染色+氟化鈉抑制實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性反應(yīng)為胞漿含有棕黑色片塊狀沉淀。PAS染色陽(yáng)性反應(yīng)為胞漿含有糖原顆粒，顆粒細(xì)小呈紫紅色，其含量按下述標(biāo)準(zhǔn)賦分：胞漿內(nèi)無(wú)顆?；蚍奂t色物質(zhì)賦0分；含有1～9個(gè)紅色小顆粒或有1圈顆粒賦1分；含有10～20個(gè)紅色顆粒或有2圈顆粒賦2分；含有許多紅色顆粒，組成3個(gè)環(huán)或成塊狀賦3分；含有許多粗顆粒組成環(huán)或2個(gè)以上大團(tuán)塊賦4分[7]。

1.6MLL基因重排分析

1.6.1 RNA提取和cDNA合成 分離患兒初診骨髓樣本中的單個(gè)核細(xì)胞, 并凍存于-80℃冰箱備用。根據(jù)Trizol試劑盒 (美國(guó)Life Technology公司)說(shuō)明提取總RNA, 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度。采用隨機(jī)逆轉(zhuǎn)錄引物 (美國(guó)Invitrogen公司) , 將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 凍存于-20℃冰箱, 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6.2 多重?zé)晒釶CR方法分析MLL基因重排MLL基因重排檢測(cè)采用熒光白血病/淋巴瘤43種融合基因檢測(cè)試劑盒(上海源奇生物科技有限公司)?？蓹z測(cè)到涉及MLL基因的11種染色體易位，包括MLL-AF4、MLL-AF9、MLL-AF6、MLL-AF10、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-AF17、MLL-AF1q、MLL-AF1p、MLL-AFX和MLL-SEPT6。

1.7 臨床特征及預(yù)后相關(guān)性因素采集 初診外周血WBC(×109·L-1)：分為<50和≥50；發(fā)病年齡(歲)：分為1～10、<1或>10；MLL亞型：歸納為MLL-AF4、MLL-AF9、MLL-ENL和其他類(lèi)型；潑尼松治療反應(yīng)：第8 d外周血幼稚淋巴細(xì)胞數(shù)<1 000·μL-1為良好、≥1 000·μL-1為不良；第33 d微小殘留病變(MRD)：分為<10-4、～10-2和≥10-2；第78 d MRD：分為<10-3、>10-3。CR:患兒未發(fā)生任何事件，骨髓檢測(cè)幼稚淋巴細(xì)胞<5%。復(fù)發(fā)：治療過(guò)程中或結(jié)束后，骨髓幼稚淋巴細(xì)胞≥5%或者發(fā)生髓外白血病浸潤(rùn)。3年無(wú)事件生存率(EFS)：從治療開(kāi)始后連續(xù)3年未發(fā)生復(fù)發(fā)或第二腫瘤的概率。

1.8 隨訪 根據(jù)病歷記錄隨訪是否發(fā)生復(fù)發(fā)和死亡，如無(wú)上述不良事件發(fā)生，則通過(guò)電話隨訪其預(yù)后，隨訪截止日期為2018年11月31日。隨訪時(shí)間：自診斷至發(fā)生事件或研究隨訪截止日期。事件定義為死亡、復(fù)發(fā)或發(fā)生第二腫瘤。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。利用精確概率法χ2檢驗(yàn)比較MLL+組和MLL-組形態(tài)學(xué)差異；采用非參數(shù)檢驗(yàn)比較MLL+組和MLL-組PAS染色陽(yáng)性率和賦分值的差異；生存率分析采用Kaplan-Meier法；MLL+組形態(tài)學(xué)陽(yáng)性亞組和陰性亞組EFS比較采用Log-Rank檢驗(yàn)。通過(guò)ROC分析骨髓細(xì)胞不典型形態(tài)特征對(duì)患兒預(yù)后的識(shí)別能力。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 26例符合MLL+組的納入標(biāo)準(zhǔn), 男12例, 女14例；年齡0.4～13歲, 中位年齡1.0歲。MLL-AF4+6例、MLL-AF9+5例、MLL-ENL+6例、其他類(lèi)型9例(MLL-AF10+3例、MLL-MLL+2例，MLL-AF6+、MLL-ELL+、MLL-SEPT6+和MLL-AF1p+各1例)。18例處于完全長(zhǎng)期緩解狀態(tài)，5例骨髓復(fù)發(fā)，3例確診后放棄治療。30例符合MLL-組的配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，男16例, 女14例；年齡0.8～14歲, 中位年齡2.0歲。

2.2 骨髓細(xì)胞形態(tài)和組織化學(xué)染色特征MLL+組和MLL-組分別有23.1%(6/26)和36.7%(11/30)原始、幼稚淋巴細(xì)胞未見(jiàn)空泡、偽足、顆粒和核仁；余分別具有1～4個(gè)上述形態(tài)特征。表1顯示，MLL+組與MLL-組的核仁、嗜天青顆粒、空泡和偽足的檢出率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 MLL+組和MLL-組骨髓細(xì)胞形態(tài)特征的比較[n(%)]

MLL+組和MLL-組患兒的POX染色、氯醋酸AS-D萘酚染色、非特異性醋酸AS-D萘酚酯酶染色+氟化鈉均為陰性。MLL+組PAS染色陽(yáng)性率為0～71%(中位數(shù)為4.0%)，賦分為0～129(中位數(shù)為4.0)分；MLL-組PAS染色陽(yáng)性率為0～92%(中位數(shù)為26.0%)，賦分為0～282(中位數(shù)為38.0)分。MLL+組PAS染色陽(yáng)性率與賦分值均顯著低于MLL-組，P分別為0.007和0.012，Z分別為-2.706和-2.529。

2.3MLL+組臨床和生物學(xué)特征與骨髓原始、幼稚淋巴細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)相關(guān)性分析 表2顯示，骨髓原始、幼稚淋巴細(xì)胞核仁、嗜天青顆粒、空泡和偽足的形態(tài)特征與初診時(shí)外周血WBC、性別、年齡不相關(guān)；6例MLL-AF4融合基因陽(yáng)性者均有核仁，其他MLL重排者具有核仁的比例顯著低于MLL-AF4+者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)。無(wú)偽足患兒第33 d MRD≥10-4的比例高于有偽足的患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025)。其他形態(tài)特征與患兒早期治療反應(yīng)，包括第8 d潑尼松反應(yīng)和第78 d MRD均不相關(guān)。

2.4MLL+組預(yù)后的預(yù)測(cè) 26例MLL+組患兒隨訪時(shí)間為1～54(中位時(shí)間為40)個(gè)月，3年EFS(72.2±10.6)%。表2顯示，骨髓原始、幼稚淋巴細(xì)胞具有核仁、嗜天青顆粒、空泡和偽足形態(tài)患兒的預(yù)后均差于無(wú)這些形態(tài)表現(xiàn)者；圖1A顯示，有、無(wú)核仁的患兒3年EFS[(55.0±15.0)%vs. 100%]差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.049)；有、無(wú)嗜天青顆粒的患兒3年EFS[(41.7±22.2)%vs. (83.9±10.4)%]，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.052); 圖1C顯示，比較同時(shí)具有核仁和顆粒者、具有核仁或者顆粒表現(xiàn)之一者、無(wú)核仁和顆粒者3年EFS分別為(26.7±22.6)%、(75.0±15.3)%和100%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)。聯(lián)合核仁和顆粒對(duì)MLL+組患兒預(yù)后的ROC曲線分析結(jié)果顯示，聯(lián)合預(yù)測(cè)能力優(yōu)于分別預(yù)測(cè)(0.833、0.786和0.705)，P值分別為0.023、0.051和0.162(圖1D)。

表2 骨髓形態(tài)特征與MLL基因重排陽(yáng)性患者臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性[n(%)]

圖1骨髓原始、幼稚淋巴細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)3年生存率

3 討論

骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查是白血病診斷和分型的基本方法，通過(guò)對(duì)骨髓涂片中原始及幼稚粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等進(jìn)行分類(lèi)和計(jì)數(shù)，可初步區(qū)分白血病類(lèi)型。在臨床工作中，有些ALL患者的骨髓細(xì)胞除了原始和幼稚淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征外，常具有AML原始粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的表現(xiàn)，如細(xì)胞可見(jiàn)偽足，胞漿中具有嗜天青顆粒。這些跨系的形態(tài)特征是否與患者的亞型相關(guān)，其存在是否與患者預(yù)后相關(guān)？MLL

基因重排是造血系統(tǒng)惡性腫瘤中常見(jiàn)的遺傳學(xué)改變，在ALL和AML中均可檢出，且在AML中常與原始和幼稚單核細(xì)胞形態(tài)相關(guān)[8]，在ALL中其形態(tài)特征卻未見(jiàn)相關(guān)研究和報(bào)道。本文分析了MLL+組和MLL-組ALL的骨髓細(xì)胞形態(tài)特征，雖然MLL+組ALL患兒具有空泡、偽足、顆粒和核仁的形態(tài)特征發(fā)生率比MLL-組更高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示ALL上述形態(tài)特征與MLL基因重排不相關(guān)。

組織細(xì)胞內(nèi)的糖原、糖蛋白或黏多糖等糖類(lèi)成分，可被過(guò)碘酸氧化暴露醛基，并與無(wú)色堿性品紅發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，生成紫紅色復(fù)合物。通過(guò)顯微鏡觀察PAS染色細(xì)胞，可定位、定性和定量這些糖類(lèi)物質(zhì)，用以判斷細(xì)胞類(lèi)型[9]。ALL的原幼淋細(xì)胞PAS染色多為紅色顆?；驂K狀陽(yáng)性反應(yīng)，有較高的陽(yáng)性率，可能與細(xì)胞糖原含量較多有密切關(guān)系[10]。而AML的原粒細(xì)胞呈陰性或胞質(zhì)呈彌漫淡色陽(yáng)性反應(yīng)[11]。本文發(fā)現(xiàn)，MLL+組PAS的陽(yáng)性率和賦分值均顯著低于MLL-組，提示MLL+組患兒的白血病細(xì)胞發(fā)生分化阻滯的時(shí)間較早，可能阻滯于造血早期的干祖細(xì)胞，因此呈現(xiàn)出原?；蛘咴瓎蔚娜旧卣鳎@也反映了MLL基因重排白血病細(xì)胞常常具有雙表型的原因。

此外， 本文結(jié)果還顯示，MLL+組6例MLL-AF4+的患兒均可見(jiàn)到清晰的核仁，而其他類(lèi)型僅有部分可見(jiàn)，提示MLL-AF4易位和核仁的形成有關(guān)。核仁的主要功能是進(jìn)行核糖體組裝與rRNA的合成，其隨細(xì)胞的代謝狀態(tài)和細(xì)胞周期而改變，蛋白質(zhì)合成旺盛的細(xì)胞核仁大，反之核仁很小。在腫瘤細(xì)胞中核仁深染，其形態(tài)反映了腫瘤細(xì)胞活躍的 RNA 代謝和蛋白質(zhì)合成[12]。提示MLL-AF4易位的白血病細(xì)胞，其腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成和增殖比其他亞型更加旺盛。

有研究表明，細(xì)胞偽足是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要結(jié)構(gòu)。細(xì)胞偽足包括絲狀偽足、片狀偽足、侵入性偽足和足體等。 絲狀偽足和片狀偽足在腫瘤侵襲起始階段起粘附作用。侵入性偽足和足體形成的關(guān)鍵分子是 WASP和 N-WASP，可誘導(dǎo)快速的肌動(dòng)蛋白重組，形成細(xì)胞突起，對(duì)腫瘤細(xì)胞突破血管壁的基底膜至關(guān)重要[13]。本文結(jié)果顯示，有偽足的患兒第33 d骨髓MRD≥10-4的比例顯著低于無(wú)偽足的患兒， 3年EFS僅為(62.5±17.1)%，低于無(wú)偽足患兒的(78.8±13.4)%，可能與白血病細(xì)胞轉(zhuǎn)移出骨髓，從而導(dǎo)致MRD檢測(cè)數(shù)值減低。因此，尚需擴(kuò)大樣本例數(shù)以明確偽足和MRD、患兒預(yù)后及髓外浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移等臨床特征的關(guān)系。

本文結(jié)果還顯示，具有核仁、嗜天青顆粒、空泡、偽足形態(tài)特征的患兒預(yù)后均差于無(wú)這些表現(xiàn)的患兒，且這一差異在具有核仁或嗜天青顆粒的患兒中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)具有上述兩個(gè)不典型形態(tài)特征的MLL+患兒預(yù)后更差，3年EFS僅為(26.7±22.6)%，對(duì)患兒預(yù)后的預(yù)測(cè)能力更強(qiáng)，ROC曲線下面積可達(dá)0.833。胞漿顆粒大多為營(yíng)養(yǎng)貯藏物，貯藏高能磷酸鹽，嗜堿性較強(qiáng)，而核仁反映細(xì)胞蛋白質(zhì)合成旺盛。因此，提示具有顆粒和核仁的MLL基因重排陽(yáng)性ALL患兒，其白血病細(xì)胞代謝更加旺盛，增殖更加迅速，其預(yù)后不良。

綜上所述，MLL基因重排陽(yáng)性ALL患兒骨髓細(xì)胞形態(tài)常見(jiàn)AML原始和幼稚細(xì)胞的形態(tài)特征。雖然該型患者具有相同的基因異常，但仍可通過(guò)患者細(xì)胞形態(tài)中核仁和嗜天青顆粒等特征，區(qū)分患者預(yù)后。分子遺傳學(xué)診斷技術(shù)和評(píng)估方法的飛速發(fā)展，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)結(jié)合組化染色檢查不僅是ALL診斷最直接和經(jīng)濟(jì)的重要手段，還可為臨床醫(yī)生提供患者重要的預(yù)后信息，故其在臨床診斷和評(píng)估中仍具有重要意義和價(jià)值。