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(西安文理學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院 西安市環(huán)境與食品安全檢測工程研究中心，陜西 西安 710065)

西安文理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)專業(yè)的質(zhì)量檢測方向，旨在培養(yǎng)可以從事食品、藥物、材料等方面進(jìn)行分析檢測的綜合應(yīng)用型人才。要求學(xué)生掌握基本的分析檢測方法，具備合格檢測人員應(yīng)有的基本素養(yǎng)，并具有較強(qiáng)的分析問題和解決問題的能力。目前，本專業(yè)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容多為驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，且實(shí)驗(yàn)方法及檢測技術(shù)較為陳舊，難以調(diào)動學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性，達(dá)不到全面培養(yǎng)學(xué)生綜合實(shí)驗(yàn)素質(zhì)的目標(biāo)，因此對現(xiàn)有檢測方法進(jìn)行更新，結(jié)合科研實(shí)驗(yàn)成果，設(shè)計(jì)了以1,8-萘酰亞胺探針對乳品真蛋白乳品中酪蛋白進(jìn)行定量分析的綜合實(shí)驗(yàn)。

由于中國國家標(biāo)準(zhǔn)中乳品蛋白質(zhì)檢測方法的缺陷，出現(xiàn)摻加尿素、銨肥、三聚氰胺等氮含量高的有機(jī)物來提高“蛋白質(zhì)含量”的違法操作，嚴(yán)重制約了我國乳制品的質(zhì)量提升，影響了消費(fèi)者的身體健康，也為不法分子摻加劣質(zhì)蛋白以提高蛋白質(zhì)含量提供可乘之機(jī)[1-2]。因此，食品分析必須從真蛋白質(zhì)測試入手，測定真蛋白質(zhì)含量，才能夠有效避免假冒劣質(zhì)蛋白質(zhì)的濫竽充數(shù)。熒光探針法是蛋白質(zhì)檢測及分析中常用的方法之一，具有快速、高效、儀器簡單、操作簡便等特點(diǎn)。但熒光探針在使用中普遍存在的一個問題是，當(dāng)熒光官能團(tuán)聚集時會發(fā)生熒光減弱或猝滅的現(xiàn)象[3]。近期本課題組的研究表明，1,8-萘酰亞胺熒光探針對酪蛋白的同步熒光呈現(xiàn)強(qiáng)烈的AIE特性，具有顯著的選擇性識別作用，經(jīng)前期研究表明，探針的羧基官能團(tuán)可能滲入酪蛋白內(nèi)部，以疏水作用及氫鍵作用結(jié)合酪蛋白疏水腔中的色氨酸及酪氨酸殘基，而萘酰亞胺發(fā)光團(tuán)及4-號位取代基團(tuán)被阻擋在外部，聚集在膠團(tuán)表面，呈現(xiàn)聚集誘導(dǎo)發(fā)光增強(qiáng)特性，導(dǎo)致酪蛋白同步熒光增強(qiáng)效應(yīng)[4-5]。

綜上所述，本綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求學(xué)生制備1,8-萘酰亞胺熒光探針，并研究其對酪蛋白膠團(tuán)聚集誘導(dǎo)發(fā)光效應(yīng)的作用機(jī)制，以建立具有普遍適用性、高效快速的酪蛋白熒光探針檢測分析法。實(shí)驗(yàn)范圍較廣，設(shè)計(jì)方案新穎，與實(shí)際應(yīng)用緊密相連，能夠極大調(diào)動學(xué)生學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)的積極性，教學(xué)效果良好。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器

藥品：正丁醇(分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；乙二醇丁醚(分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)；十六烷基三甲基溴化銨(分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；4-溴-1,8-萘酐(分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；十八胺(分析純，上海阿拉丁試劑有限公司)。

儀器：恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；顯微熔點(diǎn)測定儀(北京泰克儀器有限公司)；熒光分光光度計(jì)(日本島津制作所)；傅立葉變換紅外光譜儀(德國布魯克公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

(1)掌握1,8-萘酐亞胺探針的制備方法。

(2)了解紅外光譜(FTIR)、紫外吸收(UV-Vis)以及熒光光譜確定有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的方法。

(3)掌握1,8-萘酐亞胺探針對酪蛋白聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性的研究方法。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

(1)4-溴-N-十八烷基-1,8-萘酰亞胺。稱取2.0781g(0.0075 mol)4-溴-1,8-萘酐(A)和1.5291 g(0.0083 mol)十八胺(B)溶于100 mL無水乙醇中，磁力攪拌加熱至60 ℃回流，再降溫至50 ℃反應(yīng)4 h，待反應(yīng)液冷卻后抽濾，將濾餅真空干燥得到白色固體粉末2.6410 g，即得到中間產(chǎn)物4-溴-N-十八烷基-1,8-萘酰亞胺(G)。產(chǎn)率79.4%，熔點(diǎn)：165.3～166.3℃。

(2)1,8-萘酐亞胺探針的制備。稱取中間產(chǎn)物(G)1.056g(0.0020 mol)加入到50 mL燒瓶中，分別加入氫氧化鈉固體顆粒0.5 g，十六烷基三甲基溴化銨0.5 g，正丁醇25 mL，蒸餾水10 mL，磁力攪拌加熱至80 ℃，反應(yīng)6 h，得到黃色渾濁液，待反應(yīng)液冷卻后，抽濾、水洗、干燥得到亮黃色固體。將亮黃色固體溶解于適量的無水乙醇中，冷卻至2～5 ℃，靜置24 h后，加入適量的蒸餾水，待固體完全析出，抽濾，真空干燥，得到黃綠色固體粉末4-丁氧基-N-十八烷基-1,8-萘酰亞胺，硅膠柱層析，二氯甲烷為淋洗液。

(3)1,8-萘酐亞胺探針結(jié)構(gòu)的測定。1,8-萘酐亞胺的FTIR分析在德國布魯克公司的衍射儀傅立葉變換紅外光譜儀上進(jìn)行；1,8-萘酐亞胺的UV-Vis分析在北京普析通用儀器有限公司的紫外分光光度儀上進(jìn)行；1,8-萘酐亞胺的熒光特性在日本島津制作所的熒光分光光度儀分析。

(4)1,8-萘酐亞胺探針對酪蛋白誘導(dǎo)發(fā)光性能的測定。通過探針Scatchard方程計(jì)算探針與酪蛋白的結(jié)合參數(shù)，從而研究其對酪蛋白誘導(dǎo)發(fā)光性能的影響。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 1,8-萘酐亞胺探針制備過程中需注意的問題

制備1,8-萘酐亞胺探針時，如何確定中間產(chǎn)物以及目標(biāo)產(chǎn)物提純時重結(jié)晶等操作的溶劑的用量、溫度、時間等因素的影響。重結(jié)晶的結(jié)果直接影響到目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)，對產(chǎn)品的應(yīng)用起到相當(dāng)關(guān)鍵的作用，重結(jié)晶時需要考慮的因素較多，因此需要確定最優(yōu)的重結(jié)晶的提純條件。要求學(xué)生提前查閱文獻(xiàn)資料，通過調(diào)變反應(yīng)溫度及物料配比提高1,8-萘酐亞胺探針的產(chǎn)率較高，并確定1,8-萘酐亞胺探針的優(yōu)化制備工藝。

2.2 1,8-萘酐亞胺探針的結(jié)構(gòu)測定

1,8-萘酰亞胺分子結(jié)構(gòu)上的萘環(huán)具有較大的共軛π鍵和平面結(jié)構(gòu)，通過1,8-萘酐與十八胺的亞胺化反應(yīng)，可以得到含有萘酰亞胺結(jié)構(gòu)的熒光化合物。因此，在測定1,8-萘酰亞胺探針結(jié)構(gòu)的時候，應(yīng)當(dāng)選用紅外光譜(FTIR)、紫外吸收(UV-Vis)以及熒光光譜共同對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確定。在此基礎(chǔ)上，要求學(xué)生掌握各種測試方法及結(jié)構(gòu)分析的方法。

圖1 1,8-萘酰亞胺探針FTIR圖譜

圖2 1,8-萘酰亞胺探針UV-Vis 圖譜

1,8-萘酰亞胺探針UV-Vis 譜圖如圖2所示。學(xué)生由UV-Vis 圖譜可以看出化合物在波長為430.5 nm附近具有最大吸收峰，表明該種化合物的分子結(jié)構(gòu)中存在較大的共軛關(guān)系和電子離域性。1,8-萘酰亞胺探針的紫外全波長掃描呈現(xiàn)較好的吸收，吸收曲線平滑，可能是該種化合物樣品的純度較高，且在乙醇溶液中的穩(wěn)定性較好。

1,8-萘酰亞胺探針熒光光譜如圖3所示。學(xué)生由圖3-B中可以看出，1,8-萘酰亞胺探針的激發(fā)波長在λex=450 nm，通過確定激發(fā)波長，可以得到該化合物的發(fā)射波長范圍，且最大發(fā)射波長為545 nm，熒光相對強(qiáng)度較大，可能是引入的十八烷基和正丁基增大了萘酰亞胺分子結(jié)構(gòu)的共軛性和平面結(jié)構(gòu)。

圖3 1,8-萘酰亞胺探針的激發(fā)光譜(A,λex=450nm)和發(fā)射光譜(B,λem=545nm)

2.3 1,8-萘酐亞胺探針對酪蛋白聚集誘導(dǎo)發(fā)光效應(yīng)的影響

酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白質(zhì)，大約占到總蛋白含量的80%，主要以膠團(tuán)狀態(tài)存在于乳中，它是以含磷蛋白質(zhì)為主體的幾種蛋白質(zhì)的復(fù)合體，其中，酪蛋白含有大量疏水性的酪氨酸殘基。色氨酸和酪氨酸殘基位于位于酪蛋白疏水腔第一和第二子域之間，對于酪蛋白膠團(tuán)的自組裝具有重要作用，同時也是酪蛋白在350 nm附近內(nèi)源性熒光的主要體現(xiàn)基團(tuán)設(shè)想探針的雙羧基作為前導(dǎo)嵌入式基團(tuán)插入酪蛋白疏水腔中，與色氨酸和酪氨酸殘基以非共價(jià)鍵作用，如疏水、氫鍵作用等相結(jié)合，導(dǎo)致未結(jié)合的氨基酸殘基包埋在疏水腔中，使得酪蛋白膠團(tuán)結(jié)構(gòu)更加緊實(shí)；而1,8-萘酰亞胺熒光基元則吸附于膠團(tuán)表面導(dǎo)致探針分子的聚集，引起聚集誘導(dǎo)發(fā)光效應(yīng)。

探針與酪蛋白的結(jié)合參數(shù)由Scatchard方程計(jì)算：

log[(F0-F)/F]=logK+nlog[P]

(1)

K為結(jié)合常數(shù)，F(xiàn)0、F分別為探針加入前后酪蛋白的熒光強(qiáng)度，P為探針濃度，利用log[(F0-F)/F]對log[P]作圖可求得K和n，根據(jù)van't Hoff方程：

(2)

T分別為298、302、306和310K，以lnK對1/T作圖求得ΔH，ΔS，自由能變(ΔG)由下式計(jì)算：

ΔG=ΔH-TΔS

(3)

表1 探針與酪蛋白結(jié)合參數(shù)

探針與酪蛋白結(jié)合參數(shù)列于表1中；由表1可知，ΔH 為負(fù)值、ΔS 為正值，根據(jù)Ross判斷生物大分子與小分子作用力性質(zhì)的規(guī)律表明，疏水作用及氫鍵作用為探針-酪蛋白復(fù)合物的主要結(jié)合作用力，其中疏水作用由于色氨酸殘基本身疏水性所致，而探針的雙羧基則是氫鍵作用的主要因素。

設(shè)想機(jī)理如圖4。

圖4 酪蛋白與探針聚集誘導(dǎo)發(fā)光機(jī)理圖

2.4 實(shí)驗(yàn)拓展

學(xué)生可以進(jìn)一步確定經(jīng)濟(jì)合理、安全有效、產(chǎn)物產(chǎn)率較高的合成條件。已確定反應(yīng)原料之一的4-溴-1,8-萘酐，另一種原料的確定需要綜合考慮各方面的因素，包括顏色、形狀、毒性、熔點(diǎn)、揮發(fā)性、穩(wěn)定性等物理化學(xué)性質(zhì)。

3 問題與討論

在該綜合實(shí)驗(yàn)中需要學(xué)生思考及討論的問題如下：

(1)制備1,8-萘酐亞胺探針有哪些影響條件？

(2)紫外吸收光譜確定1,8-萘酐亞胺探針結(jié)構(gòu)的原理是什么？

(3)1,8-萘酐亞胺探針對酪蛋白熒光發(fā)射性能有怎樣的影響？

4 教學(xué)特色

該實(shí)驗(yàn)是為應(yīng)用化學(xué)專業(yè)質(zhì)檢方向大三學(xué)生開設(shè)的食品檢測綜合實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過前2學(xué)年相關(guān)課程如有機(jī)化學(xué)、精細(xì)有機(jī)合成、精細(xì)化學(xué)品分析、食品質(zhì)量檢測方法、天然化學(xué)產(chǎn)物等課程的學(xué)習(xí)，學(xué)生已經(jīng)了解有機(jī)化合物的制備方法、紫外分光光度法及熒光分光光度法的基本原理。該綜合實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生獨(dú)立制備有機(jī)化合物，自主操作檢驗(yàn)檢測儀器，并對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，不但可以充分鍛煉了學(xué)生的實(shí)踐動手能力，也能夠強(qiáng)化學(xué)生的分析處理數(shù)據(jù)的能力。從實(shí)際的教學(xué)效果來看，該實(shí)驗(yàn)極大調(diào)動了學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性，能夠?yàn)閷W(xué)生后續(xù)的實(shí)際工作及進(jìn)一步的學(xué)習(xí)深造打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

5 結(jié)束語

酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白質(zhì)，大約占到總蛋白含量的80%，主要以膠束狀態(tài)存在于乳中。由于國標(biāo)中乳品蛋白質(zhì)檢測方法的缺陷，出現(xiàn)摻加尿素、銨肥、三聚氰胺等氮含量高的有機(jī)物來提高“蛋白質(zhì)含量”的違法操作，嚴(yán)重制約了我國乳制品的質(zhì)量提升，影響了消費(fèi)者的身體健康。因此，該綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)合當(dāng)前大眾關(guān)注的食品安全檢測問題，將實(shí)驗(yàn)室的科研成果轉(zhuǎn)化為教學(xué)和實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，制備出新型的1,8-萘酰亞胺探針并實(shí)現(xiàn)其對酪蛋白的檢測，對質(zhì)檢方向?qū)W生實(shí)驗(yàn)操作及創(chuàng)新能力提出了新的要求，進(jìn)一步促進(jìn)了高效科教融合及教育轉(zhuǎn)型發(fā)展。