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(1.廣西中醫(yī)藥大學 藥學院，廣西 南寧 530001；2.廣西師范學院 化學與材料學院，廣西 南寧 530001；3.廣西南寧市第五十六中學，廣西 南寧 530001)

活性氧在許多疾病的發(fā)病機制中起著重要作用，如呼吸窘迫綜合征、類風濕性關節(jié)炎、局部或全身炎癥性疾病、糖尿病、動脈粥樣硬化、癌癥和神經(jīng)退行性疾病[1-3]?；钚匝?ROS)在正常氧化代謝過程中不斷在人體內形成，并通過由具有抗氧化活性的酶組成的內源性抗氧化防御系統(tǒng)清除。但外源性細胞中活性氧由外源源形成或未被充分去除，則可能發(fā)生氧化應激。因此，抗氧化劑特別是天然抗氧化劑的清除作用受到廣泛關注[4-5]。本實驗通過冷浸法得到樹上蝦丙酮提取物，采用DPPH和羥自由基體系，評估其對自由基清除能力。

1 材料與儀器

UV1901型紫外可見分光光度計(北京普析電子科技有限公司)；樹上蝦藥材購于廣西百色；蘆丁標準品購于百靈威試劑公司(北京)。所有試劑均為分析純。

2 方法

2.1 樹上蝦丙酮提取物制備

稱取20 g樹上蝦粉末，加入200 mL丙酮(95%)，冷浸72 h。重復上述操作3次，合并提取液。旋轉蒸發(fā)回收溶劑，得到樹上蝦丙酮提取物。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 標準曲線測定

精密吸取蘆丁對照品溶液(l mg/mL)于10 mL量瓶中，分別加5%亞硝酸鈉0.4 mL，靜置6min，加入5%硝酸鋁0.4 mL，靜置6 min。加5%氫氧化鈉試液4.0 mL，用95%丙酮稀釋至刻度，搖勻。靜置15 min，在510 nm處測定吸收度。以吸收度對溶液濃度進行回歸分析，繪制標準曲線，推出回歸方程。

2.2.2 樹上蝦丙酮提取物總黃酮含量測定

將蘆丁標準溶液換為固定濃度提取物溶液，同上操作測定吸光度，多次測量求平均值。根據(jù)標準曲線計算總黃酮的蘆丁當量，總黃酮含量以每克干物質的蘆丁當量(mg)表示，并計算提取得率。

2.3 二苯基苦味肼基自由基(DPPH)體系[4]

取不同濃度樹上蝦丙酮提取物提取物溶液(0.2、0.5、0.8、1.2、1.5、1.8和2.0 mg/mL)加入8 mL DPPH(0.004%)溶液中。在最大波長處(517 nm)測吸光度，直到平衡為止。清除率計算公式如下：S %=(1-A樣品)/A空白×100%。其中，A空白為未加藥液的DPPH溶液的吸光度，A樣品為加入藥液的DPPH溶液的吸光度。

2.4 羥自由基體系

以蒸餾水將75 mmo1/L鄰二氮菲無水乙醇溶液稀釋至7.5 mmol/L，依次往50 mL比色管中加入1.0 mL濃度7.5 mmol/L鄰二氮菲溶液，5 mL pH值7.4 PBS，1.0 mL FeSO4溶液，一定量的抗氧劑溶液，1.0 mL H2O2應用液，以蒸餾水補充體積至25 mL。37 ℃保溫反應60 min，測A510。既加抗氧劑，又加H2O2的為加藥管;不加抗氧劑，只加H2O2的為損傷管;未損傷管兩者均不加。羥自由基清除率s= [A加藥-A損傷)]/[A未損傷-A損傷] 100%。若為負值，則表示此時表現(xiàn)促氧化性；若為正值，則表示此時表現(xiàn)抗氧化性。

3 結果

3.1 樹上蝦丙酮提取物總黃酮含量測定結果

以吸收度對溶液濃度進行回歸分析并繪制標準曲線，得到回歸方程為：y=9.6778x+0.0167(R =0.9992)。樹上蝦丙酮提取物的總黃酮含量根據(jù)線性方程計算得到，其總黃酮含量為31.2 mg/g。

3.2 樹上蝦丙酮提取物對DPPH自由基的清除能力

3.2.1 不同濃度提取物對DPPH自由基的清除能力

為了評估樹上蝦對自由基的清除能力，本論文測定了不同濃度樹上蝦丙酮提取物對DPPH自由基的清除能力，如圖1。在較低藥液濃度下，樹上蝦表現(xiàn)出一定的DPPH自由基清除能力，藥液濃度為0.2 mg/mL時，提取物對DPPH自由基的清除率就達到了30.9%。藥液濃度為0.5～0.8 mg/mL時，提取物對DPPH自由基的清除率超過50%，處于54.3%～68.9%的范圍。藥液濃度為1.2和1.5 mg/mL時，提取物的DPPH自由基清除率為71.5%和76.7%，分別為藥液濃度0.2 mg/mL時數(shù)值的2.31和2.48倍。藥液濃度為1.8 mg/mL時，提取物的DPPH自由基清除率達到了84.9%。

圖1 不同濃度樹上蝦丙酮提取物對DPPH自由基的清除能力

3.2.2 不同時間提取物對DPPH自由基的清除能力

圖2 不同時間樹上蝦丙酮提取物對DPPH自由基的清除能力(濃度=2.0 mg/mL)

樹上蝦丙酮提取物在不同作用時間對DPPH自由基的清除率如圖2所示?？梢姡趯渖衔r丙酮提取物加入時，提取物即表現(xiàn)出60.5%的清除率，說明該提取物與DPPH自由基的作用非常迅速。在作用時間為10 min時，樹上蝦丙酮提取物的DPPH自由基清除率為74.9%，為初始清除率的1.24倍。在作用時間為10 min后，樹上蝦丙酮提取物的DPPH自由基清除率增長較為緩慢，作用時間70 min時，樹上蝦丙酮提取物的DPPH自由基清除率為76.7%。

3.3 樹上蝦丙酮提取物對羥基自由基的清除能力

圖3表示的是樹上蝦丙酮提取物對羥基自由基的清除能力。藥液濃度為0.2 mg/mL時，樹上蝦丙酮提取物對羥基自由基的清除率為負值，表明該濃度的藥液對羥自由基表現(xiàn)出促氧化性。藥液濃度為0.5 mg/mL時，樹上蝦丙酮提取物的羥自由基清除率為正值，表明該濃度的藥液對羥自由基表現(xiàn)出抗氧化性。濃度為0.8 mg/mL時，提取物的羥自由基清除率迅速增加為36.2。濃度為1.2和1.5 mg/mL時，樹上蝦丙酮提取物的羥自由基清除率分別達到了78.5%和85.5%。隨著藥液濃度繼續(xù)增加，樹上蝦丙酮提取物的羥自由基清除率超過了100%。

圖3 樹上蝦丙酮提取物對羥基自由基的清除能力

3.4 樹上蝦丙酮提取物對DPPH和羥基自由基的EC50值

通過不同濃度的樹上蝦丙酮提取物對DPPH自由基的清除率，得到該提取物對DPPH自由基的EC50值為0.43 mg/mL。同理得出樹上蝦丙酮提取物對羥自由基的EC50值為1.06 mg/mL。該提取物對自由基具有良好的清除能力，可能與其黃酮類物質有關。

4 結論

本實驗通過冷浸的方式得到樹上蝦丙酮提取物，并測定其總黃酮含量。采用DPPH體系研究該提取物對自由基的清除能力。研究結果表明，樹上蝦丙酮提取物的DPPH自由基清除能力與藥液濃度有關，藥液濃度為0.2 mg/mL時，提取物對DPPH自由基的清除率就達到了30.9%。隨著藥液濃度增加，提取物對DPPH自由基的清除率增大，提取物的DPPH自由基清除率最高達到了84.9%。同時，樹上蝦丙酮提取物的DPPH自由基清除能力與作用時間有關，且提取物與DPPH自由基的作用非常迅速。此外，本實驗研究了樹上蝦丙酮提取物對羥自由基的清除能力，發(fā)現(xiàn)其對羥自由基表現(xiàn)出很好的清除能力。