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(安康學(xué)院 秦巴中藥資源研發(fā)中心，陜西 安康 725000)

茶多酚是茶葉中具有強(qiáng)抗氧化作用的多酚類物質(zhì)的總稱，是茶葉活性成分的重要組成部分，約占茶葉干重的15%～25%，具有抗氧化、抗衰老、抗輻射、抑菌等作用，在食品、保健品、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-2]，市場(chǎng)需求量逐年增加，雖然目前茶多酚的提取純化等工藝研究報(bào)道較多[3-5]，但是以低成本、易操作、高純度為原則的茶多酚提取純化工藝的研究是市場(chǎng)發(fā)展的持續(xù)關(guān)注點(diǎn)，仍然具有研究的意義。

茶多酚具有較強(qiáng)的極性，可溶于水和高濃度乙醇，其提取工藝主要是在50℃以上，以蒸餾水或60%～70%的乙醇為溶劑為溶劑[6]，采用超聲輔助法[7-9]、微波輔助法[10-11]等方法，對(duì)設(shè)備要求高，本文采用高濃度乙醇(80%)滲漏提取的冷提取法，從茶葉中提取茶多酚，提取方法簡(jiǎn)單，設(shè)備裝置簡(jiǎn)單，所得提取液，采用二級(jí)萃取分離[12-13]和二級(jí)柱分離[13-14]相結(jié)合的方法純化，得到的高純度的茶多酚的粉末。同時(shí)，采用直接加熱水提的方法做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，從茶葉中提取茶多酚，采用同樣的純化方法，對(duì)比冷提和熱提的提取液及純化后茶多酚的純度的差異，為茶多酚的工業(yè)化生產(chǎn)降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品純度提高數(shù)據(jù)支持，同時(shí)茶多酚的冷提純化過程還可得到少量脂溶性色素作為副產(chǎn)品。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

超聲波清洗器KH2200E(超聲頻率40kHz,超聲功率80W，加熱功率600W)昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE-52AA，上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司，傅立葉紅外光譜儀FT-IR200美國(guó)Nicolet公司，雙光束紫外-可見分光光度計(jì)，SP-1900，上海光譜儀器有限公司，高效液相色譜SPD-10AVP 日本島津，玻璃器包括：滲漏器、分液漏斗等。

茶葉為陜西省安康市本地紫陽富硒茶，茶多酚標(biāo)品購(gòu)自北京索來寶生物科技有限公司；二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、溴化鉀、甲醇均為分析純，購(gòu)自天津市百世化工有限公司，聚酰胺(200-400目)、AB-8大孔吸附樹脂購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 茶多酚的冷浸提取及純化

取低溫烘干后的茶葉10.0 g，粗粉碎(過60目篩)，以料液比為1∶15加入80% 的乙醇溶液150 mL于滲漏器中，浸泡24 h后，收集初漏液125 mL，再添加80% 的乙醇溶液，滲漏速度2 mL/min，收集續(xù)漏液50 mL左右，合并兩次滲漏液，并定容至200 mL(用做冷提液樣品，采用高效液相法測(cè)定其中茶多酚含量，見本文結(jié)果與討論部分)。

滲漏液在0.08MPa、50 ℃減壓濃縮，回收乙醇，等體積加入二氯甲烷萃取，下層無色液體即萃余相，可從其中得到副產(chǎn)物咖啡因(詳細(xì)見副產(chǎn)物分離純化)，上層抹茶色萃取相再用等體積乙酸乙酯萃取兩次，上層乙酸乙酯層為淺墨綠色，減壓濃縮，0.08MPa、45 ℃下回收乙酸乙酯，濃縮液中含有目標(biāo)產(chǎn)物茶多酚和脂溶性色素。

用膠頭滴管每次吸取少量上述濃縮液，逐滴滴加上聚酰胺樹脂柱，柱內(nèi)保留時(shí)間為30 min，先用1.5倍柱體積的去離子水洗脫去除殘留咖啡因，再用1.5倍柱體積的85% 的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液。

將上述洗脫液用膠頭滴管每次吸取少量液體逐滴滴加上AB-8樹脂，柱內(nèi)保留時(shí)間30 min，用1.5倍柱體積的85%乙醇溶液洗脫，收集淡黃色洗脫液，0.08MPa、50 ℃減壓濃縮回收乙醇，低溫烘干，得到茶多酚結(jié)晶性粉末1.4618 g，得率14.62%，標(biāo)記為茶多酚樣品1。冷浸提后的濾渣經(jīng)干燥后稱重為6.9125 g。

圖1 茶多酚冷提純化及副產(chǎn)物分離方框流程圖

Fig.1 Flow chart of tea polyphenol and by-product from cold extracting solution separation and purification

1.2.2 茶多酚的熱提取及純化

稱取10.0 g低溫烘干后的茶葉，粗粉碎(過60目篩)，加入250 mL的蒸餾水，80 ℃提取60 min后過濾，濾渣再加入200 mL的蒸餾水80 ℃提取60 min[3]，合并兩次濾液，定容至500 mL(用做熱提液樣品采用高效液相法測(cè)定其中茶多酚含量，見本文結(jié)果與討論部分)。

濾液在0.08MPa、75℃下減壓濃縮，至50 mL左右，用等體積二氯甲烷萃取，取上層再用等體積乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯0.08MPa、45℃減壓濃縮，得到茶多酚的濃縮液，柱分離純化工藝過程及條件和冷浸提取后茶多酚柱分離純化方法相同,低溫烘干后得到茶多酚結(jié)晶性粉末1.0612 g，得率10.61%，標(biāo)記為茶多酚樣品2。熱浸提后的濾渣經(jīng)干燥后稱重為5.8608 g。

圖2 茶多酚熱提純化方框流程圖

Fig.2 Flow chart of tea polyphenol from hot extraction and purification

1.3 茶多酚冷提工藝副產(chǎn)物回收及產(chǎn)量

1.3.1 咖啡因

茶多酚冷提純化過程中，二氯甲烷層中可回收副產(chǎn)物咖啡因，采取氧化鈣升華法[7]，回收得到0.0781 g白色針狀咖啡因晶體；茶多酚熱提純化過程中二氯甲烷層，回收得到0.0232 g白色針狀咖啡因晶體。

1.3.2 脂溶性色素

茶多酚冷提工藝中，利用茶葉中脂溶性色素易溶于高濃度乙醇微溶于水，不溶于二氯甲烷而易溶于乙酸乙酯的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)冷提取、萃取分離、柱分離相結(jié)合方式，從10 g茶葉中得到了副產(chǎn)物脂溶性色素0.5813 g。

1.4 茶多酚的含量/純度分析

建立高效液相色譜分析方法，對(duì)冷提、熱提的提取液和純化后的茶多酚樣品的含量/純度進(jìn)行分析。高效液相色譜條件：C18色譜柱，柱溫25 ℃，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)279 nm，流動(dòng)相：A：甲醇；B：0.1%磷酸水溶液(A∶B = 28∶72)，流速1.0 mL/min。

標(biāo)品溶液的制備：精密稱取茶多酚標(biāo)品粉末25.0 mg，于50 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶解后，置于超聲條件下30 min，定容，以0.45μm 微孔濾膜濾過，濾液作為樣品儲(chǔ)備液備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定，分別取標(biāo)品儲(chǔ)備液1、2、4、6、8、10、12 mL定容至25 mL，取10μL 進(jìn)樣。

樣品溶液的制備：冷提液和熱提液，各取10 mL，以0.45μm 微孔濾膜濾過，濾液作為樣品供試液，取1μL 進(jìn)樣；分別精密稱取茶多酚樣品1和茶多酚樣品2各5.0 mg，于10 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶解后，定容，以0.45μm 微孔濾膜濾過，濾液作為樣品供試液，取10μL 進(jìn)樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 茶多酚標(biāo)品的高效液相色譜圖及分析

在本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相條件下，測(cè)得茶多酚標(biāo)品的高效液相色譜圖如圖3所示，共有7個(gè)峰反應(yīng)了茶多酚的主要組成(數(shù)據(jù)如表1所示)，采用保留時(shí)間定性，面積加和后進(jìn)行外標(biāo)法計(jì)算含量，茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到茶多酚冷提液和茶多酚熱提液中茶多酚的含量分別為2.3033 g和1.4740 g。

圖3 茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖

Fig.3 High performance liquid chromatography of Tea polyphenol standard product

圖4 茶多酚標(biāo)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 兩種提取純化方法得到的茶多酚純度對(duì)比分析

采用高效液相法對(duì)比分析冷提純化法和熱提純化法中茶多酚的含量及純度的變化，高效液相圖譜如圖5～8所示，數(shù)據(jù)如表1、表2所示。

圖5 冷提液的高效液相色譜圖

圖6 茶多酚樣品1的HPLC圖譜

樣品序號(hào)茶多酚冷提液保留時(shí)間峰面積含量/%茶多酚樣品1保留時(shí)間峰面積含量/%12.682487614.9061.52732.698134490.2343.353723.990722312.1882.26103.99048411.1880.867534.407218940.7030.68534.39833666.8130.839746.17310439282.00032.67786.2151643287.87540.977257.9231040041.8133.25567.932323190.0008.059169.523270086.6880.84549.53288377.1092.2038714.0403194991.75010.001214.0981138515.75028.3902總和16373270.0551.25363409938.96984.6912

表2 熱提純化法的高效液相數(shù)據(jù)

圖7 熱提液的高效液相色譜圖

Fig.7 HPLC of Tea polyphenol hot extracting solution

圖8 茶多酚樣品2的HPLC圖譜

圖6和圖8對(duì)比于圖5和圖7，經(jīng)過二級(jí)萃取和二級(jí)柱分離，雜質(zhì)峰明顯減少且圖6和圖7和茶多酚標(biāo)品的HPLC圖譜在出峰的個(gè)數(shù)和位置上對(duì)應(yīng)度高；從表1和表2的數(shù)據(jù)可看到，茶多酚樣品1和茶多酚樣品2的純度分別達(dá)到了84.69%和92.02%，純度提高明顯。

3 結(jié)論

本文根據(jù)茶多酚的理化性質(zhì)，在茶多酚的提取方法上設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)單的高濃度乙醇(80%)冷浸滲漏提取的方法(冷提法)，經(jīng)HPLC法測(cè)定，得到的提取液中茶多酚含量達(dá)到了2.3033 g(占茶葉總重23.03%)，提取率高，操作方法簡(jiǎn)單、設(shè)備簡(jiǎn)單，提取液可減壓回收乙醇，溶劑循環(huán)利用，生產(chǎn)成本低，提取率和提取液的含量均高于常用的加熱提取的方法，優(yōu)勢(shì)明顯。

另外，本文采用了二級(jí)萃取和二級(jí)柱分離結(jié)合的方法進(jìn)行茶多酚提取液的純化，冷提法純化后茶多酚的得率為14.62%，純度為84.69%，熱提法純化后茶多酚的得率為10.61%，純度為92.02%。

由于冷提液的顏色是深墨綠色，和熱提的顏色區(qū)別很大，所以在冷提純化過程中，除過得到針狀咖啡因晶體外，還得到了0.5813 g脂溶性色素作為副產(chǎn)物。