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(鞍山師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 鞍山 114007)

蘑菇是自然界中種類繁多、世界分布的生物資源，我國有蘑菇1萬余種，同時也是世界上較早應(yīng)用蘑菇的國家，《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》中記載了蘑菇的藥用價值[1]。蘑菇中含有多糖類﹑甾體類、萜類、黃酮類等生物活性物質(zhì)，藥理實驗表明，蘑菇多糖具有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、增強免疫、降血脂、抗肝炎等廣泛的生物活性，已成為藥品和食品行業(yè)的開發(fā)研究方向[2-4]。榆干離褶傘(Lyophyllum ulmarium)屬白蘑科離褶傘屬，又名對子蘑、大榆蘑，是一種菌肉肥厚，香味濃郁的食用菌，在我國主要分布在東北三省，并已人工馴化栽培成功，研究者發(fā)現(xiàn)，榆干離褶傘發(fā)酵液和菌絲體具有抗氧化、保肝、溶栓作用和保護血管內(nèi)皮細(xì)胞等功效[5-7]，而子實體生物活性方面的研究鮮見報道。因此，本文采用超聲提取榆干離褶傘中多糖，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件，旨在為榆干離褶傘開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榆干離褶傘：2015年購買于吉林安圖，由鞍山師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院張福維教授鑒定為榆干離褶傘(Lyophyllum ulmarium)。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、石油醚、無水乙醇、苯酚、硫酸等試劑均為分析純：國藥集團。

1.2 儀器與設(shè)備

Cary50紫外可見分光光度計：美國Varian公司；KQ-700GVDV型三頻恒溫數(shù)控超聲波清洗器：江蘇省昆山市超聲波儀器有限公司；離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；電子天平：梅特勒-托利多(上海)有限公司；其他為實驗室常用儀器設(shè)備。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的處理

榆干離褶傘經(jīng)過洗凈，自然干燥，粉碎，備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[8]中的苯酚-硫酸法。

1.3.3 榆干離褶傘多糖的提取及測定

參照文獻(xiàn)[9]中的提取與測定法。

1.3.4 單因素試驗

準(zhǔn)確稱取一定量的榆干離褶傘樣品超聲提取。采用不同的超聲時間、超聲功率、超聲溫度、料液比進(jìn)行提取試驗，考察各因素對提取產(chǎn)率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在1.3.4試驗基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的響應(yīng)面試驗方法優(yōu)化提取工藝，試驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0.6軟件分析，得到榆干離褶傘多糖提取的最佳提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲時間對榆干離褶傘多糖得率的影響

在料液比超聲功率440 W、1∶20 (g/mL)、超聲溫度40 ℃條件下，分別經(jīng)超聲提取15、20、25、30、35min后，分析超聲時間對榆干離褶傘多糖得率的影響，如圖1所示。

圖1 超聲時間對多糖得率的影響

由圖1可知，榆干離褶傘多糖得率隨超聲時間的增加，先升高后下降，在30min時最大。原因在于超聲時間增加會使體系的溫度升高，引起多糖分解[10]，同時考慮超聲時間短，也不利于多糖從組織細(xì)胞中溶出，因此選取超聲時間為25～35min。

2.2 超聲功率對榆干離褶傘多糖得率的影響

在超聲時間25min、超聲溫度40 ℃、料液比1∶20 (g/mL)條件下，分別經(jīng)超聲功率380、410、440、470、500 W后，分析超聲功率對榆干離褶傘多糖得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 超聲功率對多糖得率的影響

從圖2可以看出，隨著超聲功率的增大，多糖得率呈先上升后下降趨勢，原因在于超聲功率的增加會破壞多糖結(jié)構(gòu)，從而降低多糖得率[11-12]。因此超聲功率選擇在380～440 W。

2.3 超聲溫度對榆干離褶傘多糖得率的影響

在超聲功率440 W、料液比1∶20 (g/mL)、超聲時間25min條件下，分別在溫度20、30、40、50、60 ℃提取后，分析超聲溫度對榆干離褶傘多糖得率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 超聲溫度對多糖得率的影響

從圖3可看出，多糖提取率隨著超聲溫度的升高先增加后下降趨勢，在50 ℃為最大，原因在于超聲溫度過高也會破壞多糖的結(jié)構(gòu)[13]。因此超聲溫度選擇在40～60 ℃。

2.4 料液比榆干離褶傘多糖得率的影響

在超聲時間25min、超聲功率440 W、超聲溫度40 ℃條件下，分別以料液比1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30提取后，分析料液比對榆干離褶傘多糖得率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 料液比對多糖得率的影響

從圖4可看出，隨著溶劑用量的逐漸增大，多糖得率先升高，在1∶20后再下降，原因是提取溶劑的增加，有利于多糖的溶出，但溶劑量過多會降低熱量密度，從而提取率下降[14]，因此料液比選擇在1∶15～1∶25。

2.5 榆干離褶傘多糖提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

2.5.1 回歸模型的建立

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，選取超聲時間、超聲功率、超聲溫度、料液比4個因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗結(jié)果見表1。

表1 試驗設(shè)計方案與結(jié)果

表1(續(xù))

對表1試驗結(jié)果進(jìn)行Design-Expert 8.0.6.1軟件分析和多元回歸擬合，得榆干離褶傘多糖得率對超聲時間(A)、超聲功率(B)、超聲溫度(C)和料液比(D)的二次多項式回歸模型：

Y=7.78-0.30A+0.032B+0.13C-0.46D-0.082AB+0.16AC-0.36AD+0.055BC-0.083BD-0.22CD-0.22A2-0.39B2-0.054C2-0.77D2

方差分析和系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表2。

表2 方差分析及回歸系數(shù)的顯著性檢驗

注： *代表差異顯著(P<0.05)；**代表差異極顯著(P<0.01)。

由分析發(fā)現(xiàn)一次項A、C、D和二次項A2、B2、D2及交互項AC、AD、CD對多糖得率的影響極顯著。同時，表2中模型P<0.0001，極顯著，失擬項(P =0.1442>0.05)不顯著，說明模型是合理的[15]，由此可見，此種試驗方法是可靠的。

2.5.2 響應(yīng)面交互作用分析與最佳提取條件的確定

方差分析中AB、BC、BD交互作用不顯著(P > 0.05)，因此只對AC、AD和CD的交互作用進(jìn)行回歸分析，根據(jù)回歸方程得出相應(yīng)的響應(yīng)面圖，如圖5所示。

圖5 不同因素交互作用對多糖得率影響的響應(yīng)面圖

響應(yīng)面坡度越陡越顯著，說明此因素對榆干離褶傘多糖得率的影響越大，反之則表明影響越小；圓形的等高線表示參數(shù)之間交互作用不顯著，橢圓形的等高線則相反[16]。由圖5可知，兩因素交互作用大小為∶ 超聲時間和料液比>超聲溫度和料液比>超聲時間和超聲溫度，與方差分析的結(jié)果相吻合。

通過響應(yīng)面回歸分析得出榆干離褶傘多糖最佳提取工藝條件的參數(shù)為：超聲時間30.21min、超聲溫度60 ℃、料液比1 ∶17.70、超聲功率414.73 W，多糖得率預(yù)測值為8.0117%；結(jié)合實際條件，選取超聲時間30min、超聲溫度60 ℃、料液比1∶18、超聲功率415 W，進(jìn)行三組重復(fù)性實驗，多糖得率為7.96%±0.03%，與預(yù)測值相近，說明優(yōu)化模型是可靠的。

3 結(jié)論

本研究在單因素超聲提取試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面軟件優(yōu)化榆干離褶傘多糖的最佳提取工藝為：超聲時間30min、超聲溫度60 ℃、料液比1∶18、超聲功率415 W，多糖得率為7.96%±0.03%，該模型回歸顯著，對試驗擬合程度好，有關(guān)榆干離褶傘多糖的活性還有待進(jìn)一步研究。