董志敏，許月明，聞 俊，蔣益萍，秦路平,,辛海量

(1.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053)

啤酒花HumuluslupulusL.是?？迫劜輰俣嗄晟葙|(zhì)蔓生藤本植物，雌性球穗花序不僅作為釀造啤酒的重要添加原料，也廣泛作為藥物應(yīng)用，具有止咳化痰、健胃、消食、安神、利尿之功效，用于緩解食欲不振、腹脹、失眠、肺結(jié)核、癔病、浮腫、膀胱炎等癥狀[1]。在我國(guó)，啤酒花被作為民族藥(中藥)收錄于《哈薩克藥物志》、《內(nèi)蒙古植物藥志》、《寧夏中藥志》、《新疆藥用植物志》、《四川中藥志》等，為藥食兩用的新疆特色資源植物，同時(shí)，在黑龍江、山東等地也有啤酒花栽培[2]。目前在歐洲，啤酒花提取物用于緩解更年期的潮熱不適以及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，啤酒花含有木脂素、黃酮、多酚以及揮發(fā)性成分，其中，木脂素中的α酸、β酸，黃酮中的黃腐酚廣受業(yè)界關(guān)注，大量研究證明其具有抗骨質(zhì)疏松作用[4-5]。綜觀啤酒花指紋圖譜研究，目前對(duì)啤酒花指紋圖譜研究甚少，要想對(duì)啤酒花進(jìn)行系統(tǒng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)，區(qū)分啤酒花栽培種與野生種，須對(duì)啤酒花進(jìn)行系統(tǒng)的指紋圖譜研究。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC指紋圖譜，研究了26批新疆不同產(chǎn)地、品種啤酒花的指紋圖譜(表1)，并對(duì)啤酒花中的7種主要成分進(jìn)行了指認(rèn)。本方法簡(jiǎn)單、方便、準(zhǔn)確、高效，可用于啤酒花的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

表1 啤酒花樣品產(chǎn)地來(lái)源及相似度

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津 LC-20AD高效液相色譜儀(配有四元梯度系統(tǒng)，PDA檢測(cè)器)；色譜柱Diamonsil C18柱(250 mm × 4.6 mm,5 μm)；LC-solution色譜工作站。AG285型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。DL-1000B 智能超聲波清洗機(jī)(上海之信儀器有限公司)。

1.2 試劑

黃腐酚(CAS：6754-58-1，純度≥98%，上海歷鼎生物技術(shù)有限公司)；啤酒花浸膏ICE-3(美國(guó)釀造化學(xué)家協(xié)會(huì))：包含類葎草酮、葎草酮、加葎草酮、類蛇麻酮、蛇麻酮、加蛇麻酮。色譜乙腈(Damas-beta有限公司)，色譜甲醇(Damas-beta有限公司)，分析磷酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 藥材

啤酒花樣品由王果平于2017年采集于新疆不同地方(表1)，并經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室辛海量副教授鑒定，密封存放于干燥陰涼處。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Diamonsil C18柱(250 mm × 4. 6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：0.1%磷酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～10 min，20%～25%B；10～12 min，25%～75%B；12～30 min，75%～78%B；30～40 min，78%～81%B；40～42 min，81%～83%B；42～60 min，83%～90%B);流速1.0 ml/min;柱壓10.2 MPa，柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)358 nm；進(jìn)樣量10 μl。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取黃腐酚26.46 mg，置于100 ml容量瓶，加甲醇稀釋至刻度線，搖勻，得黃腐酚對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密稱取啤酒花浸膏(ICE-3)466.27 mg置于100 ml容量瓶，加甲醇稀釋至刻度線，搖勻，得類葎草酮、葎草酮、加葎草酮、類蛇麻酮、蛇麻酮、加蛇麻酮對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，得對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

分別取26個(gè)不同產(chǎn)地的啤酒花，依次粉碎存放于26個(gè)存放袋中，置于陰涼處，分別等量稱取0.5 g粉末，置于26個(gè)具塞錐形瓶中，加入50%乙醇20 ml，稱重，超聲處理30 min，涼至室溫，再稱重，用50%乙醇補(bǔ)足損失重量，濾除殘?jiān)^(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<1%，相對(duì)峰面積RSD<3%，表明該方法精密度良好。

2.4.2重復(fù)性試驗(yàn)

分別取同一批啤酒花樣品適量，共6份，精密稱重，按照“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<1%，相對(duì)峰面積RSD<5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批啤酒花樣品適量，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行分析。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<1%，相對(duì)峰面積RSD<5%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 樣品測(cè)定

取26批啤酒花樣品，分別按“2.3”項(xiàng)制備供試品，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果得到19個(gè)共有峰，并對(duì)其中的黃腐酚、類葎草酮、葎草酮、加葎草酮、類蛇麻酮、蛇麻酮、加蛇麻酮進(jìn)行指認(rèn)，對(duì)照品及啤酒花樣品HPLC圖譜如圖1所示。

圖1 對(duì)照品及啤酒花樣品HPLC圖譜A.黃腐酚對(duì)照品；B.啤酒花浸膏(ICE-3)對(duì)照品；C.啤酒花樣品；9.黃腐酚；13.類葎草酮；14.葎草酮；15.加葎草酮；17.類蛇麻酮；18.蛇麻酮；19.加蛇麻酮

2.6 啤酒花指紋圖譜的建立

2.6.1內(nèi)參比峰的選擇

在各批次的指紋圖譜中，13號(hào)峰為啤酒花中主要成分類葎草酮，保留時(shí)間適中，分離度良好，且面積大，為共有峰，確定為內(nèi)參比峰。

2.6.2系統(tǒng)聚類分析

將26批啤酒花樣品各色譜峰峰面積相對(duì)于稱樣量量化處理，得到26×19矩陣信息，用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用歐氏距離進(jìn)行聚類分析，以化學(xué)距離為2.5，可以將26個(gè)樣品分為5類。聚類分析結(jié)果如圖2所示。

圖2 系統(tǒng)聚類分析樹(shù)狀圖

2.6.3共有模式的建立

采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”對(duì)26批啤酒花樣品的HPLC指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，將S1作為參照?qǐng)D譜，選取“時(shí)間窗寬度”為0.1 min，以平均數(shù)的方法生成啤酒花共有模式的指紋對(duì)照?qǐng)D譜。計(jì)算不同樣品與對(duì)照品的相似度如表1所示，啤酒花指紋圖譜見(jiàn)圖3。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

啤酒花供試品的HPLC的3D圖像顯示，在358 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下有較好吸收，基線平穩(wěn)，各峰型較好，出峰數(shù)量也較多，因此選定檢測(cè)波長(zhǎng)為358 nm。本研究考察了甲醇-0.1%磷酸水系統(tǒng)和乙腈-0.1%磷酸水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸水系統(tǒng)分離效果較好。故選定乙腈-0.1%磷酸水作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，能達(dá)到較好的分離。

3.2 系統(tǒng)聚類分析與指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

圖3 26批不同產(chǎn)地啤酒花樣品指紋圖譜

由聚類分析樹(shù)狀圖可以看出，26批啤酒花樣品以化學(xué)距離為2.5，可分為5類。第一類又細(xì)分為3組，均為栽培種，第二類均為野生種，第三類均為栽培種，包含薩斯特和扎一品種；第四類為焉耆縣的栽培種，第五類為栽培種，含有馬可波羅栽培品種。由聚類分析結(jié)果可以看出，野生種和栽培種化學(xué)成分含量差異明顯，野生種可以單獨(dú)聚成一類，栽培種之間不同品種的化學(xué)成分含量差異較大，栽培種其不同的品種也可以單獨(dú)聚類。在相似度評(píng)價(jià)中，相似度≤0.900的5批啤酒花均為野生種啤酒花。經(jīng)系統(tǒng)聚類和相似度評(píng)價(jià)分析可以得出，啤酒花化學(xué)成分含量與栽培品種和野生種的關(guān)系密切。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了啤酒花HPLC指紋圖譜，可為今后控制啤酒花的質(zhì)量提供理論依據(jù)。