郭麗平，張成宏，寧寶爍，許 敏，徐貝貝，王 雪，李異玲

肝臟是人體內(nèi)最大的內(nèi)臟器官，肝實質(zhì)細胞是肝臟主要的構(gòu)成細胞，其中肝細胞（hepatocyte，HC）約占肝臟總質(zhì)量的60%～80%，發(fā)揮胚胎造血、蛋白質(zhì)合成、膽汁酸生成、糖原儲存、解毒、新陳代謝等重要的生理功能。部分肝葉切除術(shù)或細胞毒性損傷后體內(nèi)的HC可再生補充受損的肝細胞[1，2]，而體外HC生長活性較差，對于肝臟病理生理、藥物代謝、基因治療等研究造成了一定的阻礙。1969年，由Berry和Friend[3]首先采用兩步膠原酶灌注法分離完整的HC，經(jīng)研究者不斷改良，近50年來國內(nèi)外公認獲取大鼠原代HC的方法為Segalen經(jīng)典兩步原位灌流法[4]，但這種方法適用于體型相對較大的動物，如成年大鼠、成年小鼠，乳豬等動物，便于進行動靜脈穿刺灌流并能夠獲得可觀的細胞數(shù)量。成熟大鼠原代HC在體外幾乎很難增殖，同時這種方法要求特殊的儀器、大量膠原酶和穿刺技術(shù)等多種條件,增加了實驗的難度。我們參考Charlotte et al[5，6]的實驗方法，建立了一種改良后大鼠原代HC分離技術(shù)，即在出生1～3天的大鼠，采用多步酶消化法及組織塊貼壁法分離大鼠原代HC，單層細胞培養(yǎng)原代HC。此法簡單、易操作，可保持一定的肝細胞數(shù)量和活力，也便于普通實驗室應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器 出生1～3天SPF級SD大鼠，體質(zhì)量60±10 g，雌雄不限（購于遼寧省長生生物技術(shù)公司）。Ⅳ型膠原酶（Sigma公司），0.25%Trypsin-EDTA（Gibico公司），DMEM高糖培養(yǎng)基（BI公司），胎牛血清（BI公司），抗CK-18抗體（PTG公司），鼠/兔二抗（邁新公司），DAB顯色試劑盒（邁新公司），臺盼藍（Sigma公司），糖原染色試劑盒（Solarbio公司），PBS緩沖液，0.9%氯化鈉溶液。倒置顯微鏡（Olympus公司），離心機（赫西儀器公司），水浴鍋（瑞華儀器公司），孵箱（ESCO公司），血細胞計數(shù)板、蓋玻片、200目一次性篩網(wǎng)、燒杯、15 ml離心管和50 ml離心管等。

1.2 肝細胞分離與培養(yǎng) 將出生1～3 d大鼠酒精浸泡1 min消毒，斷頭處死，小心取出肝臟，注意盡量不要剪到肝臟結(jié)締組織，用PBS緩沖液沖洗1遍，剪碎至1～3 mm3大小，PBS緩沖液反復(fù)沖洗，至組織上清幾乎為透亮溶液。棄上清，加入0.25%Trypsin-EDTA 37℃水浴消化5 min，加入完全培養(yǎng)基終止消化，棄上清，用PBS緩沖液洗滌剩余培養(yǎng)基，棄上清。繼續(xù)加入0.03%Ⅳ型膠原酶37℃水浴消化10 min，用PBS緩沖液立即稀釋膠原酶濃度，收集上清液于離心管，置于4℃。再用PBS緩沖液沖洗、吹打組織塊，收集剩余細胞，重復(fù)膠原酶消化步驟2次，將收集的所有上清液與組織經(jīng)200目細胞篩網(wǎng)過濾，50 g離心3 min，重懸細胞懸液。將收集好的細胞沉淀加入含15%血清的DMEM高糖培養(yǎng)液于A培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，在48 h首次換液時，保留四分之一原液，再加入新完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液1次。將剩余組織塊于B培養(yǎng)瓶中共同培養(yǎng)，48 h首次換液，輕輕吹打瓶底，棄掉未貼壁組織塊，方法同A瓶加入培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。取細胞懸液，以0.4%臺盼藍1：9染色，在顯微鏡下用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞，一只新生大鼠每次可獲得約1～2×106單個細胞，接種細胞瞬時活率為78.5±6.5%之間。A培養(yǎng)瓶：48 h換液，可見大約20%～30%左右的細胞貼壁，分布呈單個或3～5個細胞連成片狀，細胞較大、透亮、伸展良好、呈多邊形，可見為單核或多核，胞質(zhì)內(nèi)可見較多的分泌物。在實驗中發(fā)現(xiàn)，呈片生長的細胞增殖較快，而單個細胞生長相對緩慢，約3～5 d長滿瓶底的70%～80%，細胞呈集落生長，逐漸相互靠攏擠壓，形成規(guī)則大片狀分布；B培養(yǎng)瓶：48 h換液后，可見部分組織塊貼壁較緊，部分細胞貼壁伸展如A瓶，3 d左右組織塊附近開始出現(xiàn)生長暈，細胞爬出較多，細胞之間緊密連接，約3～5 d可長滿瓶底的70%～80%。B瓶中細胞形態(tài)相對A瓶中較多樣，有典型的肝細胞形態(tài)、亦混雜少量星狀細胞、枯否細胞等非實質(zhì)細胞，再采用選擇性貼壁法純化肝細胞。經(jīng)過傳代后，細胞形態(tài)開始發(fā)生變化，逐漸成“纖維樣”形態(tài)細胞。

2 結(jié)果

HC爬片：將長滿瓶底70%～80%細胞經(jīng)0.25%Trypsin-EDTA消化90 s，制成細胞懸液，傳于爬片之上，待24 h后，細胞幾乎全部貼壁，進行染色鑒定。

2.1 糖原染色 將HC爬片置于Canoy固定液，4℃冰箱內(nèi)固定1 h。用0.9%氯化鈉溶液清洗3次后，用濾紙吸干，將細胞爬片置于PAS試劑盒，加過碘酸氧化水溶液，避光反應(yīng)10 min，用0.9%氯化鈉溶液洗滌3次，將細胞爬片置于Schiff液中，于37℃水浴鍋內(nèi)避光反應(yīng)20 min后，用0.9%氯化鈉溶液洗3次，最后經(jīng)蘇木素復(fù)染10 s左右，用流水沖洗爬片，直到背景色被去除，晾干后在鏡下觀察。在低倍鏡下，可見HC多為雙核或多核，胞質(zhì)呈粉色，胞核呈深藍色；在高倍鏡下，在HC胞質(zhì)中可見密集粉紅色的糖原顆粒（圖1、圖2）。

圖1 HC爬片 培養(yǎng)第5 d，HC多為雙核或多核，胞質(zhì)呈粉色，胞核呈深藍色（PAS,100×）

圖2 HC爬片 培養(yǎng)第5 d，可見HC胞質(zhì)中密集呈粉紅色的糖原顆粒，糖原染色陽性比率＞95%（PAS,400×）

2.2 免疫組化染色 將HC爬片于冷丙酮（提前1 h置于4℃冰箱）中固定20 min，用0.9%氯化鈉溶液浸洗3次，將30 ml/L過氧化氫與純甲醇按l：50混合后，室溫浸泡肝細胞爬片30 min，用0.9%氯化鈉溶液洗3次，滴加封閉液5%BSA，室溫下封閉10 min，吸去多余液體，加1：200稀釋的兔抗大鼠CK-18多克隆抗體,37℃孵育30 min,用0.9%氯化鈉溶液清洗3次，再滴加聚合辣根過氧化物酶標記的抗兔 IgG，37℃孵育 30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，反應(yīng)10 min，用0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，濾紙吸干，蘇木素復(fù)染10 s左右，流水沖洗爬片，直到背景色被去除，晾干后在鏡下觀察。在低倍鏡下，可見胞質(zhì)呈均質(zhì)棕黃色，胞核呈藍色；在高倍鏡下，可見細胞內(nèi)清晰棕色顆粒和藍色胞核（圖3、圖4）。

圖3 HC內(nèi)CK-18表達 第5d，可見胞質(zhì)呈均質(zhì)棕黃色，胞核呈藍色（SP，100×）

圖4 HC內(nèi)CK-18表達 第5 d，可見細胞內(nèi)清晰的棕色顆粒和藍色胞核，棕色部分染色＞95%（SP，400×）

3 討論

肝臟是人體的代謝中心，體外培養(yǎng)的HC是用于研究肝病的常用方法。目前，國內(nèi)外應(yīng)用最多的是兩步原位膠原酶灌注大鼠肝臟，獲得的肝細胞數(shù)量可觀[7]，但成熟肝細胞在體外幾乎不增殖，細胞活性也很快下降[8]，對于后續(xù)研究及實驗觀察造成了一定的阻礙。據(jù)Crawford[9]和Wu et al[10]報道，新生大鼠HC是一種中度分化的細胞，兼具肝祖細胞和成熟HC的特性及功能，且新生大鼠HC增殖能力相對較強，是研究HC功能及肝臟病理生理等變化的最佳選擇之一。

實驗發(fā)現(xiàn)，HC是一種極其脆弱的細胞。我們首先嘗試了單用0.25%Trypsin-EDTA消化肝組織，但胰酶作用過于劇烈，作用時間不易把握，導(dǎo)致細胞活率及產(chǎn)量很不穩(wěn)定。膠原酶只消化細胞間質(zhì)部分，對細胞損害相對較弱。實驗發(fā)現(xiàn)，膠原酶處理組織塊10～15 min不會影響后期細胞存活率，且其濃度以0.03%為宜，既可以保證細胞產(chǎn)量，也不至于對細胞造成不可修復(fù)的損傷。經(jīng)過反復(fù)實驗，我們探索一種改良的方法，即先用胰酶+EDTA預(yù)處理肝組織塊5 min，棄上清（可能包含肝包膜成纖維細胞），經(jīng)過PBS洗滌，繼續(xù)使用Ⅳ型膠原酶消化剩余消化組織塊2次，每次10 min，分離HC。因組織體積較大，密度較高，運用低速梯度離心可基本去除死亡的肝細胞、細胞碎片及非實質(zhì)細胞。結(jié)合單層細胞培養(yǎng)及組織塊貼壁培養(yǎng)法,可以獲得足夠數(shù)量的肝細胞，與既往報道一致[11]。因酶消化呈中心性消化，每次消化后的組織塊需要進行充分的洗滌，防止已脫離纖維連接的細胞二次受損。HC懸液于4℃冰箱暫保存，防止細胞活性下降。實驗發(fā)現(xiàn)，細胞活率和體外操作時間呈反比關(guān)系。對于體外操作時間，我們建議不超過2 h，可確保后期細胞貼壁。若體外操作時間大于3 h，培養(yǎng)細胞24 h甚至48 h，基本無肝細胞貼壁。

實驗中還發(fā)現(xiàn)，48 h首次換液較24 h首次換液，貼壁的細胞更多，與以往的研究略有差異[12]，考慮可能受損的HC恢復(fù)其細胞膜的完整性較慢，相對需要較長時間適應(yīng)新的環(huán)境。經(jīng)觀察，48 h換液細胞組增殖能力明顯強于24 h首次換液組。在首代培養(yǎng)的HC，待長至培養(yǎng)瓶底70%～80%時傳代，目的是通過選擇性貼壁去除組織塊及枯否細胞、成纖維細胞等貼壁力較強的間質(zhì)細胞[13]，傳代時注意控制消化時間，吹打力度適中。HC基本可穩(wěn)定傳3～4代，之后細胞生長速度明顯減緩。1個月左右，細胞基本不再生長，出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，逐漸變?yōu)榭张堇w維網(wǎng)狀或細胞裂解、凋亡。

肝細胞培養(yǎng)的方式有多種，最常見的有單層細胞培養(yǎng)、與肝非實質(zhì)細胞共培養(yǎng)[14]、球狀模型培養(yǎng)[15]、“三明治”模型培養(yǎng)[16]等多種方法。在本實驗中，我們采用單層細胞培養(yǎng)，也取得了較好的效果。

據(jù)文獻報道[17，18]，HC在體外培養(yǎng)時逐漸失去上皮表型，開始退化或向成纖維化表型轉(zhuǎn)變。在本實驗中也觀察到相似的情況，在普通條件培養(yǎng)下，經(jīng)過傳代后HC逐漸呈“纖維樣”形態(tài)，但糖原和CK-18表達仍呈陽性。Payushina et al[17]提出小鼠胎鼠HC是一種多功能的間充質(zhì)干細胞。胎鼠HC經(jīng)過標準的原代培養(yǎng)及傳代后，上皮細胞逐漸消失[17，18],猜測一方面可能是在標準培養(yǎng)條件下，成纖維細胞較上皮細胞競爭力更強；另一方面，可能是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化導(dǎo)致初始表型喪失。Mansuroglu et al[19]在研究大鼠胎鼠特異性表達基因時觀察到，傳代后的大鼠胎HC不是功能性成熟肝細胞，不僅HC標志物（Prox1）的表達消失了，而且喪失了HC的白蛋白合成和AFP分泌功能。與此同時，剩余大部分細胞為Desmin陽性/α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，SMA）陽性的成肌纖維細胞，少量Desmin陽性/SMA陰性HC。成肌纖維細胞最有可能來自于胎鼠肝血管壁的間充質(zhì)細胞群，而不是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變的結(jié)果。然而，上述情況尚未得到充分的證實，需進一步完善相關(guān)研究，為肝臟病理生理、毒藥物檢測以及生物人工肝的研究提供更多的細胞保障。有報道，成熟的HC具有可塑性，可去分化形成肝祖細胞，可能為將來肝臟疾病的治療產(chǎn)生重大影響[20]。