劉鳳霞，王 瑩，薛 剛，王文慶，胡宏斌，黃亞平，張朋朋

(1.南陽理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽 473004； 2.河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽 473004； 3.河南佳尚農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，河南 魯山 467300)

油脂暴露在空氣中會(huì)自發(fā)地發(fā)生氧化反應(yīng)，生成低級(jí)脂肪酸、醛、酮等，產(chǎn)生惡劣的酸臭和口味變壞等，是油脂及含油食品酸敗變質(zhì)的主要原因[1-3]。丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、沒食子酸丙酯(PG)、叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)等化學(xué)合成抗氧化劑具有良好的抗氧化效果，在食用油中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[4-5]。然而大量的研究表明，TBHQ對(duì)動(dòng)物有致突變的可能，BHA、BHT有致癌作用[6-7]，人們對(duì)化學(xué)合成抗氧化劑的安全性產(chǎn)生了擔(dān)憂，目前很多國家已對(duì)化學(xué)合成抗氧化劑限制或暫停使用[8-9]。因此，尋找高效、無毒、安全的天然抗氧化劑已成為一個(gè)重要的研究方向。

迷迭香提取物含有多種抗氧化活性物質(zhì)并且其抗氧化效果顯著，而且迷迭香的提取物具有很高的安全性[10]。迷迭香中含多種成分，主要包括萜類、黃酮類、有機(jī)酸類等[11-12]。研究表明，以迷迭香中的二萜類化合物(包括鼠尾草酸、鼠尾草酚、異迷迭香酚等)為主要成分的抗氧化劑在使用過程中普遍具有很高的安全性、高效性和耐熱性。迷迭香中三萜類化合物應(yīng)用最廣的是熊果酸和齊墩果酸，具有抗腫瘤、抗糖尿病、抗?jié)兗敖笛葟V泛的生物學(xué)效應(yīng)，此外有研究發(fā)現(xiàn)熊果酸同樣具有抗氧化活性[13-15]。目前市售的迷迭香脂溶性抗氧化劑主要以鼠尾草酚和鼠尾草酸作為特征活性成分，基本不涉及熊果酸。有關(guān)迷迭香提取物的相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)如GB 1886.172—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 迷迭香提取物》中多以鼠尾草酸和鼠尾草酚含量標(biāo)記迷迭香脂溶物。同屬二萜類成分的鼠尾草酚和鼠尾草酸結(jié)構(gòu)相似、極性相仿，但與歸屬三萜類的熊果酸和齊墩果酸區(qū)別較大。本課題組利用這兩類成分的理化差異，采用乙醇浸提迷迭香莖葉，經(jīng)不同的濃縮條件同時(shí)得到鼠尾草酸+鼠尾草酚混合物和熊果酸+齊墩果酸混合物兩種脂溶物。本文將上述兩種脂溶物和化學(xué)抗氧化劑BHA+BHT共3組抗氧化劑添加到梔子油中，進(jìn)行氧化實(shí)驗(yàn)，測(cè)定20 d里梔子油的共軛二烯及酮類物質(zhì)生成、過氧化值、DPPH 自由基清除率、ABTS自由基清除率等指標(biāo)，研究不同迷迭香脂溶性抗氧化劑在梔子油中的抗氧化能力，為后期迷迭香中天然抗氧化成分的深入開發(fā)和資源最大化綜合利用提供參考，也為今后梔子油生產(chǎn)企業(yè)對(duì)梔子油的抗氧化劑進(jìn)一步開發(fā)和研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

迷迭香脂溶物包括熊果酸+齊墩果酸(49.92%+6.65%)的混合物、鼠尾草酸+鼠尾草酚(35.48%+2.52%)的混合物，由河南佳尚農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供。梔子油，購自南陽泰瑞生物科技股份有限公司。BHA和BHT均為食品級(jí)，DPPH、ABTS、碘化鉀等均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SB-5200DT超聲波清洗機(jī)，TGL-16C高速離心機(jī)，BSA224S-CW電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)，752N紫外可見分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

準(zhǔn)確稱取4份梔子油油樣各50 g，其中一份為空白油樣，不添加任何抗氧化劑；一份按GB/T 2760—2014要求添加0.01%的BHA+BHT，另外兩份分別按0.04%加入熊果酸+齊墩果酸混合物、鼠尾草酸+鼠尾草酚混合物。

將上述4組油樣置于25℃超聲處理5 min，磁力加熱攪拌器攪拌5 min 后裝入小油樣瓶中，儲(chǔ)藏在63℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中，每隔0、5、10、15、20 d取出一部分樣品測(cè)定4組油樣的過氧化值、共軛二烯及酮類物質(zhì)、DPPH自由基清除能力及ABTS自由基清除能力等指標(biāo)。

1.2.2 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.2.2.1 過氧化值測(cè)定

參考GB/T 5538—2005《動(dòng)植物油脂 過氧化值測(cè)定》測(cè)定油脂的過氧化值。

1.2.2.2 梔子油中共軛二烯及酮類物質(zhì)生成測(cè)定

參照GB/T 22500—2008《動(dòng)植物油脂 紫外吸光度的測(cè)定》測(cè)定梔子油的吸光值，用于表征梔子油中共軛二烯及酮類物質(zhì)生成情況。

1.2.2.3 DPPH自由基清除能力測(cè)定

用移液槍分別吸取0.08 mL的各油樣于10 mL具塞試管中，向各試管中分別加入5 mL無水乙醇，多次振蕩，使油樣充分溶解，然后向各試管中分別加入2 mL配制好的DPPH溶液(0.1 mmol/L) ，在常溫條件下黑暗靜置10 min后取出，在515 nm波長下測(cè)定吸光值，用無水乙醇作空白。

DPPH自由基清除率=(A0-A1)/A0×100%

(1)

式中：A0為DPPH溶液的吸光值；A1為加入油樣后DPPH溶液的吸光值。

1.2.2.4 ABTS自由基清除能力測(cè)定

分別吸取7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液各2 mL，混合后充分搖勻，于黑暗處靜置12～16 h后使用。取1 mL的上述混合液，用甲醇溶液調(diào)節(jié)(1 mL上述混合液大概需要51 mL甲醇)混合液的吸光值，使其在734 nm波長下的吸光值范圍為0.70±0.02，即得到ABTS反應(yīng)液。分別取15 μL的油樣于10 mL 的具塞試管中，然后向試管中分別加入6 mL的ABTS反應(yīng)液，靜置7 min 后在734 nm波長下測(cè)定吸光值。

ABTS自由基清除率=(A0-A1)/A0×100%

(2)

式中：A0為ABTS反應(yīng)液的吸光值；A1為加入油樣后ABTS反應(yīng)液的吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同抗氧化劑對(duì)梔子油過氧化值的影響

在高溫條件下，經(jīng)過20 d的儲(chǔ)藏，每隔5 d對(duì)4組油樣進(jìn)行過氧化值測(cè)定，結(jié)果見圖1。

圖1 不同抗氧化劑對(duì)梔子油過氧化值的影響

由圖1可知，在加熱實(shí)驗(yàn)中，空白、BHA+BHT、鼠尾草酸+鼠尾草酚、熊果酸+齊墩果酸4組油樣的過氧化值隨儲(chǔ)藏時(shí)間的延長均呈上升趨勢(shì)，說明梔子油一直在氧化，氧化過程中生成的過氧化物逐漸被積累，從而使得每組油樣的過氧化值均升高。

在梔子油氧化過程中，添加鼠尾草酸+鼠尾草酚的油樣過氧化值增長最為緩慢，說明其抗氧化能力在4組油樣中最強(qiáng)。

2.2 不同抗氧化劑對(duì)梔子油共軛二烯及酮類物質(zhì)的影響

在高溫條件下，經(jīng)過20 d的儲(chǔ)藏，每隔5 d對(duì)4組油樣分別在232、268 nm處進(jìn)行吸光值的測(cè)定，結(jié)果分別見表1、圖2。

表1 添加不同抗氧化劑的梔子油在232 nm處的吸光值

由表1可知，4組油樣在232 nm處的吸光值隨儲(chǔ)藏時(shí)間的延長一直在上升，說明梔子油中的一些不飽和脂肪酸被氧化生成了共軛二烯類物質(zhì)，從而使梔子油的吸光值上升。吸光值的增幅與抗氧化效果呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，對(duì)比232 nm處吸光值的變化，添加鼠尾草酸+鼠尾草酚的油樣在4組油樣中共軛二烯類物質(zhì)生成的速率最慢，說明其抗氧化能力在4組油樣中最強(qiáng)。

圖2 添加不同抗氧化劑的梔子油在268 nm處的吸光值

由圖2可知，在10 d內(nèi)4組油樣的吸光值變化不大，說明梔子油中酮類物質(zhì)的含量均無明顯變化，而在15 d以后空白樣、添加BHA+BHT和熊果酸+齊墩果酸的油樣的吸光值降低，說明油中酮類物質(zhì)含量明顯下降，而添加鼠尾草酸+鼠尾草酚的油樣的吸光值變化不大，說明油中酮類物質(zhì)含量變化不大，可能20 d的高溫儲(chǔ)藏時(shí)間太短，需要以后的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。

2.3 不同抗氧化劑對(duì)梔子油DPPH自由基清除能力的影響

在高溫條件下，經(jīng)過20 d的儲(chǔ)藏，每隔5 d對(duì)4組油樣進(jìn)行DPPH自由基清除率的測(cè)定，結(jié)果見圖3。

圖3 不同抗氧化劑對(duì)梔子油DPPH自由基清除能力的影響

由圖3可知，空白樣、添加BHA+BHT和熊果酸+齊墩果酸的油樣，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長DPPH自由基清除率總體呈下降趨勢(shì)，說明梔子油在不斷被氧化。添加鼠尾草酸+鼠尾草酚的油樣DPPH自由基清除率無明顯變化，而且DPPH自由基清除率最高，說明其抗氧化能力在4組油樣中最強(qiáng)。

2.4 不同抗氧化劑對(duì)梔子油ABTS自由基清除能力的影響

在高溫條件下，經(jīng)過20 d的儲(chǔ)藏，每隔5 d對(duì)4組油樣進(jìn)行ABTS自由基清除率的測(cè)定，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，在20 d的高溫儲(chǔ)藏實(shí)驗(yàn)中，4組油樣的ABTS自由基清除率均呈下降趨勢(shì)，說明油脂在不斷被氧化。在貯藏20 d時(shí)，添加鼠尾草酸+鼠尾草酚油樣的ABTS自由基清除率最高，說明其對(duì)梔子油的抗氧化能力優(yōu)于BHA+BHT、熊果酸+齊墩果酸和空白油樣。

圖4 不同抗氧化劑對(duì)梔子油ABTS自由基清除能力的影響

3 結(jié) 論

通過將迷迭香脂溶物添加到梔子油中，并與添加化學(xué)抗氧化劑的梔子油對(duì)比共軛二烯及酮類物質(zhì)生成、過氧化值、DPPH自由基和ABTS自由基清除率的差異，研究迷迭香脂溶物對(duì)梔子油的抗氧化效果。結(jié)果表明：在梔子油氧化過程中，高溫儲(chǔ)藏20 d，添加鼠尾草酸+鼠尾草酚的油樣的過氧化值始終最低，說明鼠尾草酸+鼠尾草酚抗氧化能力最強(qiáng)；添加鼠尾草酸+鼠尾草酚的油樣在4組油樣中共軛二烯類物質(zhì)生成的速率最慢，說明其抗氧化能力在4組油樣中最強(qiáng)；4組油樣中酮類物質(zhì)含量變化不太明顯，說明20 d的高溫儲(chǔ)藏時(shí)間太短，需要以后的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究；添加鼠尾草酸+鼠尾草酚油樣的DPPH自由基、ABTS自由基清除能力在4組油樣中最強(qiáng)；BHA+BHT和熊果酸+齊墩果酸之間抗氧化能力的大小還需要以后的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較。

綜上，鼠尾草酸+鼠尾草酚的抗氧化能力強(qiáng)于熊果酸+齊墩果酸和BHA+BHT。實(shí)驗(yàn)可為油脂抗氧化成分添加以及迷迭香脂溶物對(duì)油脂抗氧化性各指標(biāo)影響研究奠定基礎(chǔ)，也可以為新型油脂抗氧化劑的開發(fā)提供新的研究思路與途徑。