宋雪婷，趙永騰，余旭亞

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 昆明 650500)

化石燃料是不可再生能源，目前化石燃料的過度使用導(dǎo)致能源危機(jī)日益嚴(yán)重，因此開發(fā)和利用可再生能源成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[1]。生物能源的出現(xiàn)為解決目前面臨的能源短缺問題提供了一種新思路，生物柴油作為生物能源的典型代表，因具有可再生、清潔、環(huán)保、十六烷值高等優(yōu)點(diǎn)，而被作為化石能源的理想替代品[2]。產(chǎn)油微藻由于具有油脂含量高、生長(zhǎng)周期短、光合效率高等優(yōu)點(diǎn)成為當(dāng)前生產(chǎn)生物柴油的最佳原料，也成為陸生植物利用的一種潛在替代物[3]。但微藻在傳統(tǒng)培養(yǎng)條件下存在生物量和油脂產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本高等一系列問題，阻礙了產(chǎn)油微藻的大規(guī)模應(yīng)用[4]。

微藻油脂的合成受多種因素的影響。研究表明，氮饑餓是促進(jìn)各種微藻中油脂積累和調(diào)控脂肪酸組成最有效的方法[5]。非生物脅迫條件雖能增加油脂含量，但在一定程度上會(huì)降低微藻的生物量。生物柴油生產(chǎn)需要大量的生物質(zhì)提供原料，生物量的降低使得生物柴油的商業(yè)化生產(chǎn)受到了制約，這一限制可以通過兩階段培養(yǎng)策略解決，即異養(yǎng)培養(yǎng)-光化學(xué)誘導(dǎo)。

褪黑素(Melatonin，MT)是一種吲哚類色胺，化學(xué)名稱為 N-乙酰-5-甲氧基色胺，是一種內(nèi)源性的植物激素，具有抗氧化活性。研究顯示，MT作用類似于吲哚乙酸(IAA)和細(xì)胞分裂素(CK)，在綠色植物中能夠調(diào)節(jié)光周期及植物生長(zhǎng)。此外，作為抗氧化劑，MT可以消除活性氧、提高抗氧化酶活性等[6]。這種作用類似于甜菜堿和黃腐酸，在非生物脅迫條件下，可以促進(jìn)微藻細(xì)胞內(nèi)油脂積累[7]。由此推測(cè)，缺氮條件下，外源MT可能會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)微藻中油脂的積累。

本文研究了缺氮條件下，添加外源MT對(duì)單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1生長(zhǎng)、油脂積累以及生理生化指標(biāo)的影響，并探討了MT對(duì)活性氧(ROS)含量及相關(guān)抗氧化酶活性的影響，分析了外源MT調(diào)控藻細(xì)胞中ROS含量和油脂合成之間的關(guān)系，為促進(jìn)微藻油脂積累提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

單針藻Monoraphidiumsp. QLY-1 ，篩選、保存于本實(shí)驗(yàn)室。MT，購(gòu)于生工生物工程有限公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒，丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)測(cè)定試劑盒，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒，均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。所用試劑均為分析純，購(gòu)自昆明鼎國(guó)試劑公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TS-1102恒溫振蕩搖床，F(xiàn)A2004N分析天平，LDZX-50KBS滅菌鍋，VS-840-1超凈工作臺(tái)， Ultrospec 2100pro紫外可見分光光度計(jì)，RF-540熒光分光光度計(jì)(Shimadzu)，TS-2011GZ恒溫光照振蕩搖床，5804R高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，1730R高速冷凍離心機(jī)(丹麥Labogene Scanspeed公司)，F(xiàn)D5-12冷凍干燥機(jī)(西盟國(guó)際集團(tuán))，Agilent 7890A系列氣相色譜儀(Agilent Technologies)，Agilent 5975C系列質(zhì)譜儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微藻培養(yǎng)

以BG-11培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1接種于含有250 mL培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，25℃、150 r/min、異養(yǎng)培養(yǎng)(葡萄糖10 g/L)11 d。

1.2.2 MT誘導(dǎo)處理

將異養(yǎng)種子分別接種到自養(yǎng)BG-11培養(yǎng)基及自養(yǎng)缺氮BG-11培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基體積250 mL)，接種量為1 g/L。以缺氮BG-11培養(yǎng)基作為對(duì)照組，添加MT(1 μmol/L)為處理組，在光照強(qiáng)度30 μmol/(m2·s)，溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下培養(yǎng)。每天收集藻細(xì)胞，測(cè)定單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1的生物量和油脂含量。

1.2.3 碳水化合物和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

按照葡萄糖測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定碳水化合物中葡萄糖的含量。利用牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 ROS和MDA含量的測(cè)定

分別按測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定。

1.2.5 抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性的測(cè)定

分別按測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 生物量和油脂含量的測(cè)定

取10 mL體積的藻液，通過離心收集 (5 000 r/min,10 min)，置于-80℃冰箱冷凍2 h以上取出，用真空冷凍干燥機(jī)冷凍48 h，之后稱量干藻粉的質(zhì)量。以每升藻液中干藻粉的質(zhì)量表示生物量。

微藻油脂提取及含量測(cè)定采用Bligh等[8]的方法。微藻細(xì)胞內(nèi)的油脂主要包裹在細(xì)胞壁中，需要進(jìn)行細(xì)胞破壁，之后利用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，具體操作步驟見Zhao等[9]方法。

1.2.7 油脂分級(jí)

用1 mL的氯仿溶解1.2.6所提取的油脂，利用硅膠層析進(jìn)行分離。具體方法如下：用30 g的硅膠填充硅膠柱(25 mm×25 mm)，將氯仿溶解的油脂110℃加熱過夜，并加入到硅膠柱中，連續(xù)用2/3柱體積的氯仿沖洗6次，丙酮沖洗4次，甲醇沖洗4次。將氯仿相沖洗所得液體烘干即為中性脂，丙酮相沖洗所得液體烘干即為糖脂，甲醇相沖洗所得液體烘干即為磷脂[10]。

1.2.8 脂肪酸組成分析

提取的微藻油脂添加2 mL 3%硫酸-甲醇溶液，于70℃水浴回流4 h進(jìn)行甲酯化后，取2 mL正己烷萃取4 h，萃取相過濾后待GC-MS分析。

色譜條件：Agilent 7890A系列氣相色譜儀；HP-5MS 毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣，壓力 0.137 9 MPa；升溫程序?yàn)?0℃，保持1 min，以20℃/min升溫至180℃，然后以6℃/min升溫至230℃，保持20 min；進(jìn)樣量1 μL，分流比50∶1。

質(zhì)譜條件：Agilent 5975C系列質(zhì)譜儀；進(jìn)樣口溫度250℃；接口溫度270℃；離子源溫度230℃；電離電壓70 eV；四極桿溫度150℃；載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min；掃描方式為全掃描模式，掃描范圍(m/z)30～450。

峰值與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所(NIST)質(zhì)量光譜庫(NIST08.L)的質(zhì)量光譜進(jìn)行比較，以保留時(shí)間定性，用面積歸一化法計(jì)算脂肪酸的含量[9]，其中不飽和度等于2倍的多不飽和脂肪酸與單不飽和脂肪酸之和。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

全部實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3組平行，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，通過ANOVA(SPSS19.0)一步法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。最小顯著性差異進(jìn)行多重比較，檢驗(yàn)組間差異，且當(dāng)P< 0.05具有顯著性差異，P< 0.01具有極顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 缺氮聯(lián)合MT誘導(dǎo)對(duì)單針藻Monoraphidium sp. QLY-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(見圖1)

圖1 不同處理?xiàng)l件對(duì)單針藻Monoraphidium sp. QLY-1 生物量的影響

由圖1可知，缺氮(ND)條件下，MT處理組和對(duì)照組微藻的生長(zhǎng)都較為緩慢，均低于BG-11培養(yǎng)基下的生物量；在外源MT誘導(dǎo)下，48 h藻細(xì)胞的生物量略高于對(duì)照組條件下的。結(jié)果表明，藻細(xì)胞在BG-11培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快，最高生物量達(dá)到1.12 g/L。而在缺氮條件下，外源MT依然可以維持微藻的生長(zhǎng)，可能是由于MT提高了微藻利用細(xì)胞內(nèi)氮的能力。這與Babu等[11]報(bào)道的結(jié)果，即在氮限制條件下，添加植物激素IAA和DA-6能夠促進(jìn)Chlorellasorokiniana利用細(xì)胞內(nèi)的氮源進(jìn)行生長(zhǎng)相一致。

2.2 缺氮聯(lián)合MT誘導(dǎo)對(duì)單針藻Monoraphidium sp. QLY-1油脂含量的影響(見圖2)

注：與BG-11相比，*為顯著性差異(P<0.05)，**為極顯著差異(P<0.01)。

圖2不同處理?xiàng)l件對(duì)單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1油脂含量的影響

由圖2可知，在缺氮條件下，單針藻油脂含量從26.87%提高到42.06%，增加了15.19個(gè)百分點(diǎn)。MT聯(lián)合缺氮處理下，其油脂含量最高達(dá)到51.38%，是對(duì)照組的1.22倍，與先前研究結(jié)果相比，油脂含量增勢(shì)明顯[12]。油脂積累的增長(zhǎng)反映了缺氮和MT的互作效應(yīng)。缺氮可促進(jìn)單針藻中油脂的積累，外源MT聯(lián)合缺氮可進(jìn)一步促進(jìn)油脂的積累。此現(xiàn)象可能是由于缺氮條件下MT調(diào)控了藻細(xì)胞內(nèi)碳的再分配，從而提高了微藻中油脂的積累。此外，單針藻中油脂的積累也可能與胞內(nèi)有機(jī)物的轉(zhuǎn)化有關(guān)，比如降解蛋白質(zhì)及碳水化合物，從而為藻細(xì)胞積累油脂提供碳源和能量[7]。

在微藻油脂含量增加的同時(shí)，其油脂組分也發(fā)生了變化。在MT誘導(dǎo)下微藻中的油脂組分變化如圖3所示。

注：**為與對(duì)照相比存在極顯著差異(P<0.01)。

圖3不同處理?xiàng)l件對(duì)單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1油脂分級(jí)的影響

由圖3可見，中性脂含量在MT處理下從45%增加至59.31% 。糖脂含量下降了5.7個(gè)百分點(diǎn)，這可能是由于糖脂向中性脂的轉(zhuǎn)換。此結(jié)果與Yoon等[13]發(fā)現(xiàn)微藻在低光照條件下糖脂向中性脂的轉(zhuǎn)化一致。而磷脂與對(duì)照組無顯著性差異。

2.3 缺氮聯(lián)合MT誘導(dǎo)對(duì)單針藻Monoraphidium sp. QLY-1生理生化指標(biāo)的影響(見圖4)

圖4不同處理?xiàng)l件對(duì)單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1碳水化合物(A)和蛋白質(zhì)(B)含量的影響

碳水化合物、蛋白質(zhì)是微藻的主要成分，在非生物脅迫條件下其可能改變并轉(zhuǎn)化成為油脂[14]。由圖4可知，與油脂含量變化相反，在24 h添加MT的誘導(dǎo)條件下碳水化合物含量從37.69%下降至25.24%，對(duì)照組從37.69%下降至28.39%。MT聯(lián)合缺氮誘導(dǎo)，藻細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量最高達(dá)到20.82%，72 h蛋白質(zhì)含量從20.82%下降至14.73%；而對(duì)照組蛋白質(zhì)含量從21.27%下降至15.55%，Che等[7]的研究也呈現(xiàn)了類似的結(jié)果，微藻在高鹽、高光照、氮饑餓的條件下會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量的降低和油脂含量的增加[15]。在MT處理下，碳水化合物和蛋白質(zhì)含量的下降可能與氮源、光照強(qiáng)度和碳的再分配有關(guān)，這與Zhang等[16]的研究結(jié)果，即鹽脅迫下微藻ChlorellasorokinianaSDEC-18中淀粉向脂質(zhì)合成的轉(zhuǎn)化一致。Li等[12]也發(fā)現(xiàn)MT聯(lián)合光誘導(dǎo)下，微藻中蛋白質(zhì)和碳水化合物的降低伴隨著脂質(zhì)的積累。

2.4 缺氮聯(lián)合MT誘導(dǎo)對(duì)單針藻Monoraphidium sp. QLY-1細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA含量的影響(見圖5)

注：與對(duì)照組相比，*為顯著性差異(P<0.05)，**為極顯著差異(P<0.01)。

圖5不同處理?xiàng)l件對(duì)單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1細(xì)胞中ROS(A)和MDA(B)含量的影響

ROS作為信號(hào)分子，涉及多個(gè)細(xì)胞代謝過程以及防御相關(guān)的基因表達(dá)，對(duì)微藻油脂的積累發(fā)揮著重要作用，其信號(hào)傳導(dǎo)途徑及其作用的機(jī)制已經(jīng)成為近年來研究的熱點(diǎn)[17]。由圖5可見，對(duì)照組前24 h藻細(xì)胞內(nèi)的ROS含量顯著性增加，24 h后ROS含量緩慢下降之后趨于平緩，添加MT誘導(dǎo)下呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，但是ROS含量明顯低于對(duì)照組。

丙二醛(MDA)是反映細(xì)胞膜脂過氧化程度的指標(biāo)，其含量的高低可表明微藻細(xì)胞在鹽脅迫、強(qiáng)光以及氮饑餓等非生物脅迫條件下引起細(xì)胞氧化損傷的程度[12]。由圖5可見，在整個(gè)培養(yǎng)階段，藻細(xì)胞內(nèi)的MDA含量總體上是增加的，但是前48 h外源MT的添加使得藻細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著低于對(duì)照組，24 h對(duì)照組的MDA含量是其1.84倍(P<0.01)。與對(duì)照組相比，添加MT的MDA含量變化與脂質(zhì)積累呈現(xiàn)相反趨勢(shì)，表明MT在脂質(zhì)積累的過程中降低了MDA含量，對(duì)藻細(xì)胞可能起到了一定的保護(hù)作用，促進(jìn)了藻細(xì)胞中脂質(zhì)的積累。

缺氮條件下能夠增加ROS、MDA的含量，外源MT的添加能夠降低藻細(xì)胞內(nèi)的ROS和MDA的含量，使微藻細(xì)胞避免因環(huán)境脅迫造成的氧化損傷，保持細(xì)胞的正常代謝。Yu等[18]研究表明添加植物激素組與不添加組相比，顯著降低了缺氮條件下細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA的含量，保護(hù)微藻免受氧化應(yīng)激的影響。MT作為一種有效的抗氧化劑，可有效地清除胞內(nèi)過量的ROS以及由氮缺乏引起的細(xì)胞損傷[14]。氮脅迫條件下，外源MT可調(diào)節(jié)微藻在油脂積累過程中的ROS和MDA含量，且微藻中油脂的積累與胞內(nèi)ROS和MDA含量呈現(xiàn)出相負(fù)相關(guān)。

2.5 缺氮聯(lián)合MT誘導(dǎo)對(duì)單針藻Monoraphidium sp. QLY-1細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的影響(見圖6)

注：與對(duì)照組相比，*為顯著性差異(P<0.05)，**為極顯著差異(P<0.01)。

圖6不同處理?xiàng)l件對(duì)單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1細(xì)胞中SOD(A)、POD(B)、CAT(C)的影響

由圖6可知，外源MT聯(lián)合缺氮誘導(dǎo)條件下，導(dǎo)致藻細(xì)胞內(nèi)與ROS含量密切相關(guān)的抗氧化酶活性的升高。SOD催化超氧化物自由基和氫分解產(chǎn)生H2O2和O2，為對(duì)抗由ROS引起的毒性提供了第一道防線[19]。如圖6A所示，在MT的處理下，誘導(dǎo)24 h SOD的活性達(dá)到最高(39.45 U/mg)，是對(duì)照組的1.46倍(P<0.01)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD的活性整體趨于降低，96 h降至26.19 U/mg。這與Yu等[18]在ScenedesmusSDEC-8和ChlorellasorokinianaSDEC-18中發(fā)現(xiàn)SOD的活性變化相似。

POD是代謝的末端氧化酶之一，屬呼吸功能相關(guān)的酶，能催化H2O2分解。如圖6B 所示，MT處理?xiàng)l件下，POD活性于24 h達(dá)到最高(33.94 U/mg)，是對(duì)照組的1.38倍(P<0.01)，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但總體上看，48 h和72 h 時(shí)也明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。

CAT 能夠消除H2O2對(duì)細(xì)胞的損傷，將其代謝為H2O和O2，從而保護(hù)機(jī)體免受自由氧基的損害[20]。由圖6C可知，在MT的處理下，前24 h藻細(xì)胞內(nèi)的CAT活性與對(duì)照組沒有顯著性差異，均呈現(xiàn)顯著性增加的趨勢(shì)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，CAT活性總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在72 h CAT活性是對(duì)照組的2.86倍(P<0.01)。

上述結(jié)果表明，在缺氮條件下，ROS含量的增加導(dǎo)致細(xì)胞氧化性損傷，從而引起細(xì)胞免疫防御系統(tǒng)啟動(dòng)，3種抗氧化酶作為應(yīng)答氧化脅迫的主要效應(yīng)物，與對(duì)照組相比，在MT處理下均呈現(xiàn)明顯增加的趨勢(shì)。這與彭金良等[21]添加α-萘酚脅迫對(duì)普通小球藻中抗氧化酶活性的變化一致。但在培養(yǎng)后期3種抗氧化酶活性呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，這可能與蛋白質(zhì)的降解有關(guān)[22]。因此，外源MT調(diào)控缺氮條件下藻細(xì)胞內(nèi)ROS含量與相關(guān)抗氧化酶活性有關(guān)。

2.6 缺氮聯(lián)合MT誘導(dǎo)對(duì)單針藻Monoraphidium sp. QLY-1脂肪酸組成的影響(見表1)

表1 不同處理?xiàng)l件對(duì)單針藻Monoraphidium sp. QLY-1脂肪酸組成的影響 %

由表1可知，缺氮條件下外源MT的添加導(dǎo)致單針藻Monoraphidiumsp. QLY-1脂肪酸組成變化。棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、亞油酸(C18∶2)和亞麻酸(C18∶3)是脂肪酸的主要組成成分，C16∶0與對(duì)照組相比提高了2.82 個(gè)百分點(diǎn)，C18∶0 和C18∶2分別是對(duì)照組的1.10倍和1.12倍。在MT的處理下，飽和脂肪酸含量從50.78%增加至55.81%，比對(duì)照組提高了5.03個(gè)百分點(diǎn)，在一定程度上飽和脂肪酸含量的升高可生產(chǎn)出較高氧化穩(wěn)定性及十六烷值的生物柴油；單不飽和脂肪酸含量從3.56%提高至5.24%，是對(duì)照組的1.47倍；其不飽和度(DU)與對(duì)照組相比差別不大。Li等[12]用1 μmol/L 褪黑素誘導(dǎo)藻細(xì)胞，與對(duì)照相比脂肪酸組成和DU值無顯著性變化。

3 結(jié) 論

在缺氮條件下，單針藻油脂含量從26.87%提高到42.06%，增加了15.19個(gè)百分點(diǎn)，外源MT聯(lián)合缺氮條件下，其油脂含量最高可達(dá)到51.38%，是對(duì)照組的1.22倍。外源MT聯(lián)合缺氮誘導(dǎo)藻細(xì)胞產(chǎn)生了一系列的生理反應(yīng)，藻細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和碳水化合物含量下降，且MT能夠有效清除氮饑餓條件下藻細(xì)胞內(nèi)積累的過量ROS，降低MDA水平，提高與清除ROS相關(guān)的3種抗氧化酶的活性，這些變化都與促進(jìn)藻細(xì)胞內(nèi)的油脂積累相關(guān)。隨著MT誘導(dǎo)微藻脂質(zhì)積累機(jī)制的進(jìn)一步研究，外源添加MT聯(lián)合缺氮培養(yǎng)有望成為微藻生產(chǎn)油脂的一種有效策略。